水稻粳粳交后代花藥培養(yǎng)技術(shù)的初探

段　敏，謝留杰，唐興國(guó)，黃善軍，潘曉飚*（.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物研究所，浙江臨海 37000；.臺(tái)州市作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨海 37000）

水稻粳粳交后代花藥培養(yǎng)技術(shù)的初探

段敏1，2，謝留杰1，唐興國(guó)2，黃善軍1，潘曉飚1，2*
（1.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物研究所，浙江臨海 317000；2.臺(tái)州市作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨海 317000）

以甬粳13-54/丙13-07和甬粳13-54/丙04-08（分別編號(hào)F2-17和F2-19）2個(gè)水稻粳粳交F2代為試驗(yàn)材料，通過(guò)改變培養(yǎng)基中碳源、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、激素、活性炭等成分配比，建立一套適用于本生態(tài)區(qū)粳稻育種材料的花藥培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，M 8+6%麥芽糖+2 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT+1 mg·L-1NAA+ 100 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1谷氨酰胺+100 mg·L-1水解酪蛋白為誘導(dǎo)培養(yǎng)基效果較好，2種材料的花藥誘導(dǎo)率分別為5.56%和12.74%；分化培養(yǎng)基中KT∶6-BA=1∶4時(shí)可促進(jìn)愈傷組織萌發(fā)出更多的綠點(diǎn)，綠點(diǎn)率可達(dá)47.42%。另外無(wú)論是愈傷組織誘導(dǎo)率還是綠點(diǎn)萌發(fā)均顯示F2-19的花藥培養(yǎng)效率高于F2-17。

水稻；花藥；愈傷組織；活性炭；有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物

文獻(xiàn)著錄格式：段敏，謝留杰，唐興國(guó)，等.水稻粳粳交后代花藥培養(yǎng)技術(shù)的初探［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1045-1049.

植物花藥培養(yǎng)技術(shù)已成為當(dāng)今生物技術(shù)育種中較為成熟實(shí)用的育種技術(shù)。自1964年印度德里大學(xué)的Guha和Maheshiwari從毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中獲得單倍體植株后，相繼有煙草、水稻、小麥等植物成功獲得單倍體植株［1］。由于單倍體植株經(jīng)加倍后可以獲得純合二倍體，在育種上可快速獲得穩(wěn)定的遺傳后代，故花藥培養(yǎng)技術(shù)逐漸受到各國(guó)育種家的重視，目前在生產(chǎn)實(shí)踐中已體現(xiàn)出巨大的價(jià)值。我國(guó)的水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)研究始于20世紀(jì)70年代，至今已取得一系列可喜的成果，選育出多個(gè)水稻花培品種并被廣泛應(yīng)用［2-3］。除了選育花培品種，水稻花藥培養(yǎng)還被成功應(yīng)用在核質(zhì)互作雄性不育系的提純復(fù)壯［4-5］、光溫敏核不育系的選育［6-8］及品種改良［9］等多個(gè)領(lǐng)域中。

盡管水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)水平日益提高，但實(shí)際操作中由于基因型差異、培養(yǎng)基種類差異以及培養(yǎng)環(huán)境等因素的影響，往往難以獲得較大的再生植株群體，使后代選擇受到較大的限制［10］。因此，提高花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)效率、擴(kuò)大花培后代群體是水稻花藥培育種成敗的關(guān)鍵。本研究選擇2個(gè)水稻粳粳交后代作為試驗(yàn)材料，通過(guò)改變誘導(dǎo)培養(yǎng)基碳源、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、活性炭等成分，探索出一套適用于本生態(tài)區(qū)粳稻育種材料花藥培養(yǎng)體系，為日后該地區(qū)水稻育種的發(fā)展提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1供試材料

以甬粳13-54/丙13-07雜交F2代和甬粳13-54/丙04-08雜交F2代2個(gè)水稻品系為試材，分別編號(hào)為F2-17和F2-19，均由臺(tái)州市農(nóng)科院作物所選育，種植于臺(tái)州市農(nóng)科院小溪基地。

本試驗(yàn)于2015年9—12月在本院進(jìn)行。待試驗(yàn)材料生長(zhǎng)至孕穗期，劍葉葉枕與倒二葉葉枕距離5 cm左右時(shí)，于陽(yáng)光充沛、天氣晴朗的午后從大田中選取健壯無(wú)病斑的水稻主莖或第一分蘗幼穗，保留2片葉子，帶回實(shí)驗(yàn)室用1%的I2-KI溶液鏡檢。選取小孢子發(fā)育處于單核早中期的穗子，經(jīng)75%乙醇表面擦拭后，用濕紗布及塑料膜包好放入冰箱冷藏（7℃）8～10 d。

1.2花藥接種及愈傷組織誘導(dǎo)

將低溫處理后的幼穗以枝梗為單位分開，每15～20支為1束浸入次氯酸鈉飽和溶液中消毒10～15 min，超凈工作臺(tái)上無(wú)菌水沖洗3～4次。在無(wú)菌條件下用鑷子將花藥小心取出，接種于固體培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)皿直徑為6 cm，接種花藥80～100枚。（26±2）℃條件下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.3愈傷組織分化和植株再生

待花藥膨脹、愈傷組織從花藥中長(zhǎng)出后，從第25～70天，分次將直徑大小在1～3 mm左右的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)綠苗分化，光照條件為2 000 1x，12 h·d-1，溫度設(shè)置（26±1）℃。待幼苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)移入生根培養(yǎng)基中生根，統(tǒng)計(jì)綠苗率及白苗率。待苗長(zhǎng)至7～8 cm時(shí)，打開瓶蓋煉苗3 d，再移入溫室。

1.4培養(yǎng)基類型

愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基以M8為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入6%麥芽糖或3%麥芽糖+3%蔗糖作為碳源。激素種類包括2，4-D（2.0 mg·L-1），KT（0.5 mg·L-1），NAA（1.0 mg·L-1）。以0.3%植物凝膠固化，pH調(diào)節(jié)至5.8左右。另?yè)?jù)需求加入氨基酸、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、活性炭等。誘導(dǎo)培養(yǎng)基具體成分及含量見表1。

表1　愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分的組合和配比

愈傷分化培養(yǎng)基以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入6%麥芽糖，脯氨酸100 mg·L-1，谷氨酰胺500 mg·L-1，酸水解酪蛋白100 mg·L-1，并以0.3%植物凝膠固化，調(diào)節(jié)pH值至5.8左右。激素種類的成分及含量詳見表2。

表2　愈傷組織分化培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分的組合和配比mg·L-1

生根培養(yǎng)基的主要成分為1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2%蔗糖，激素種類包括IBA（0.5 mg· L-1）和多效唑（4.0 mg·L-1），另外加入0.3%活性炭，以0.3%植物凝膠固化，pH調(diào)節(jié)至5.8左右。

所有培養(yǎng)基采用0.11 MPa、121℃高溫高壓滅菌20 m in，冷卻后備用。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

花藥出愈率/%=愈傷組織總數(shù)/接種花藥數(shù)×100；

綠點(diǎn)率/%=出綠點(diǎn)的愈傷數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100；

綠苗率/%=綠苗個(gè)數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100；試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Exce1統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4種不同成分配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。從表3可以看出，2種水稻花藥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基R1、R3上基本未誘導(dǎo)出愈傷組織，在R2、R4培養(yǎng)基上均誘導(dǎo)出愈傷組織。比較R1、R2的結(jié)果，說(shuō)明混合碳源（麥芽糖+蔗糖）的效果優(yōu)于單一麥芽糖碳源。R3與R4相比，不含活性炭的R4能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明活性炭在誘導(dǎo)過(guò)程中不是必須的。綜合來(lái)看，混合碳源的誘導(dǎo)效果好，而外加有機(jī)物（如氨基酸、水解蛋白等）可能與活性炭有所沖突，需避免同時(shí)使用。至于混合碳源與有機(jī)物同時(shí)使用的效果是否優(yōu)于單一碳源（R4），還需進(jìn)一步分析。

表3　不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)水稻花藥出愈率的影響

2.2分化培養(yǎng)基中激素含量對(duì)綠點(diǎn)率及綠苗率的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了2種分化培養(yǎng)基，二者主要不同在于激素KT與6-BA的含量比例有所差異。由于R1、R3上基本沒(méi)有長(zhǎng)出愈傷組織，故以R2、R4誘導(dǎo)培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移的愈傷組織數(shù)分析綠點(diǎn)率、綠苗率。

從表4看出，2種分化培養(yǎng)基上的愈傷組織均能萌發(fā)出綠點(diǎn)，而D2的綠點(diǎn)率高于D1，說(shuō)明KT∶6-BA=1∶4的激素比更有利于愈傷組織的分化。大多數(shù)愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基后會(huì)褐化，這是正?，F(xiàn)象。但隨著時(shí)間推移，褐化程度越發(fā)嚴(yán)重，使得原本有綠點(diǎn)的部位也隨之褐化。試驗(yàn)結(jié)果未能得到一株綠苗。

表4　不同分化培養(yǎng)基對(duì)水稻花藥愈傷組織綠點(diǎn)率的影響

2.3基因型對(duì)花藥培養(yǎng)效率的影響

供試的2種水稻品系均為粳粳交的F2代，父本相同，母本不同。從表3看出，F(xiàn)2-17的花藥在R2上誘導(dǎo)出的愈傷組織較多，F(xiàn)2-19在R4上能夠誘導(dǎo)出更多的愈傷組織，說(shuō)明不同基因型的花藥培養(yǎng)效率不同。由于R1、R3的誘導(dǎo)率極低，故以R2、R4誘導(dǎo)培養(yǎng)基上接種的花藥分析兩個(gè)水稻品系的花藥培養(yǎng)效率。如表5所示，無(wú)論是出愈率還是綠點(diǎn)率F2-19均比F2-17高，表明F2-19的花藥培養(yǎng)效率高于F2-17。

表5　不同水稻基因型的花藥培養(yǎng)效率對(duì)比

3　討論

3.1培養(yǎng)基成分對(duì)花藥培養(yǎng)效率的影響

水稻花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基、碳源、激素、瓊脂以及其他成分等。經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)和比較，目前得到普遍適用于水稻花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有適合粳稻的N6［11］、秈稻的合5［12］，以及對(duì)粳秈稻均有較好效果的通用［13］和M8［14］等。各種基本培養(yǎng)基的主要差別在于比例不同。本研究所用的M8培養(yǎng)基的摩爾比為3.5∶28，低于N6的7∶28，與郭書巧等［14］分析的水稻秈粳交后代及其親本的花藥培養(yǎng)技術(shù)使用的基本培養(yǎng)基一致，2種基因型的水稻花藥愈傷誘導(dǎo)率為5.56%～12.74%，誘導(dǎo)效果較好。

本研究設(shè)計(jì)了4種不同成分配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，混合碳源（麥芽糖+蔗糖）的誘導(dǎo)效果優(yōu)于單一碳源（麥芽糖），這與朱永生等［15］提出混合使用蔗糖和麥芽糖對(duì)出愈率及培養(yǎng)力的改善效果更佳這一說(shuō)法相符合。Tara D［16］指出水解酪蛋白等有機(jī)物的添加可以增加花藥培養(yǎng)力，而谷氨酰胺、丙氨酸等有助于愈傷組織的形成。試驗(yàn)中培養(yǎng)基R4以麥芽糖作為單一碳源，添加一定含量的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物（脯氨酸，谷氨酰胺及水解酪蛋白）后也顯示出較好的誘導(dǎo)效果，說(shuō)明外加氮源可以提高花藥愈傷誘導(dǎo)率。

外源激素是促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的重要因素。許多試驗(yàn)證明，多激素配比使用比單一激素的誘導(dǎo)和分化效率高［14，17-18］，采用復(fù)合啟動(dòng)因子誘導(dǎo)愈傷組織可促進(jìn)培養(yǎng)力低的材料的愈傷誘導(dǎo)和綠苗分化。本試驗(yàn)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用2，4-D+KT+ NAA的混合激素，愈傷組織誘導(dǎo)率超過(guò)5%；分化培養(yǎng)基使用KT+6-BA+NAA的混合激素，能夠促進(jìn)較多的綠點(diǎn)產(chǎn)生，說(shuō)明混合激素適用于粳粳交后代花藥培養(yǎng)體系。

活性炭具有良好的吸附能力，至今已大量用于林木、禾谷類、蔬菜及其他經(jīng)濟(jì)作物的植物組織培養(yǎng)。有研究表明，加入適量的活性炭，能夠吸附離體培養(yǎng)中的抑制物并降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，但同時(shí)也會(huì)吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［19］。本試驗(yàn)中前3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基均加入0.15%的活性炭，但僅R2有愈傷組織長(zhǎng)出；相對(duì)應(yīng)的未加活性炭的R4愈傷組織誘導(dǎo)效率顯著提高，說(shuō)明活性炭在本試驗(yàn)愈傷組織的誘導(dǎo)過(guò)程中不是必須的，且在添加有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的條件下不需加入活性炭。綜合來(lái)看，適宜本試驗(yàn)中的2種粳粳交后代的花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是M8+6%麥芽糖+2，4-D+KT+NAA+脯氨酸+谷氨酰胺+水解酪蛋白。今后試驗(yàn)中可以嘗試同時(shí)使用混合碳源+有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的誘導(dǎo)方法。

3.2愈傷組織褐化影響綠苗得率

褐化現(xiàn)象是指在外植體誘導(dǎo)初分化或再分化過(guò)程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象［20］。本試驗(yàn)中愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基后約10 d開始有綠點(diǎn)產(chǎn)生。隨著時(shí)間推移，愈傷組織開始褐化（培養(yǎng)基并未變褐色）且褐化程度愈發(fā)嚴(yán)重，最終導(dǎo)致包括綠點(diǎn)在內(nèi)的愈傷組織均褐化死亡，沒(méi)有分化出幼苗。顯然愈傷組織的褐化是沒(méi)有分化出幼苗的重要原因，如何降低愈傷組織的褐化程度是解決低出苗率的關(guān)鍵。

引起褐化現(xiàn)象的因素很多，包括材料選擇、培養(yǎng)基成分和形態(tài)、光溫培養(yǎng)條件等［21］。試驗(yàn)中2 000 1x、12 h·d-1的光照條件以及（26±1）℃的溫度設(shè)置可能不適宜綠苗的分化，需要考慮進(jìn)一步減少光照并適當(dāng)降低溫度。盡管有報(bào)道顯示，添加氨基酸能夠提高綠苗分化率并減少愈傷組織的褐化［14，22］，但本試驗(yàn)中的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的添加并未促進(jìn)綠苗的分化。黃翠紅等［23］在研究水稻秈型恢復(fù)系花藥培養(yǎng)時(shí)提出，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機(jī)物的添加雖然有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但同時(shí)對(duì)愈傷組織的后續(xù)分化存在一定程度的負(fù)效應(yīng)。另外，添加活性炭能降低培養(yǎng)基的透光率，提高愈傷組織的分化率［22］。綜合來(lái)看，今后試驗(yàn)中可將有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、活性炭作為分化培養(yǎng)基的變量進(jìn)行分析。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S511

B

0528-9017（2016）07-1045-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160727

2016-03-08

臺(tái)州市農(nóng)業(yè)類一般項(xiàng)目（15ny04）；臺(tái)州市院地合作項(xiàng)目（TYD-001-2）；浙江省9410計(jì)劃資助項(xiàng)目

段 敏（1986—），女，安徽合肥人，農(nóng)藝師，博士，主要從事水稻抗逆分子育種及組織培養(yǎng)工作，E-mai1：biyutianshi929 @sina.com。

潘曉飚（1966—），男，高級(jí)農(nóng)藝師，E-mai1：tzxbpan@163.com。