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      萬古霉素耐藥折點(diǎn)調(diào)整對異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌篩選方法的影響

      2016-09-09 10:55:13劉明濤李凱述歐陽修河
      中國感染與化療雜志 2016年4期
      關(guān)鍵詞:折點(diǎn)葡菌平皿

      劉明濤,李凱述,李 超,歐陽修河

      萬古霉素耐藥折點(diǎn)調(diào)整對異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌篩選方法的影響

      劉明濤,李凱述,李 超,歐陽修河

      目的 探討耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(金葡菌)(MRSA)對萬古霉素耐藥的折點(diǎn)調(diào)整后,對異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌(hVISA)的平皿篩選方法選擇的影響,尋求一種敏感、有效的平皿篩選方法。方法 收集臨床MRSA菌株215株,分別用濃度為6 mg/L、4 mg/L、2 mg/L萬古霉素腦心浸液瓊脂平皿(BHIV6、BHIV4、BHIV2)及濃度為5 mg/L替考拉寧腦心浸液瓊脂(BHIT5)進(jìn)行hVISA篩選,同時(shí)應(yīng)用菌群分析/曲線下面積(PAP/AUC)法檢測hVISA,以PAP/ AUC法作為金標(biāo)準(zhǔn),對比上述4種平皿篩選方法的敏感度及特異度。結(jié)果 PAP/AUC檢測hVISA的陽性菌株分別為12株,BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5篩選陽性菌株分別為6、18、54、20株;以PAP/AUC法作為金標(biāo)準(zhǔn),上述4種平皿篩選方法靈敏度分別為 41.7 %、83.3 %、91.7 %、83.3 %,特異度分別為 99.0 %、95.9 %、77.8 %、94.8 %。結(jié)論 MRSA對萬古霉素耐藥折點(diǎn)調(diào)整后,BHIV6篩選法靈敏度較低、BHIV2篩選法特異度較低,不應(yīng)作為hVISA的篩選方法,BHIV4和BHIT5平皿篩選法靈敏度和特異度均較高,可作為萬古霉素耐藥折點(diǎn)調(diào)整后對hVISA的常規(guī)篩選方法。

      金黃色葡萄球菌; 萬古霉素耐藥; 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法

      近年來,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(金葡菌)(MRSA)檢出率逐年升高[1],隨著萬古霉素的廣泛應(yīng)用,出現(xiàn)了對萬古霉素敏感性下降的金葡菌,包括萬古霉素中介金葡菌(VISA)和異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌(hVISA),其中VISA目前臨床檢出率較低[2],但世界各地陸續(xù)有hVISA的報(bào)道,檢出率在0.5 %~20 %[3-4]。目前檢測hVISA的初篩方法較多,但應(yīng)用最為廣泛的篩選方法為含藥瓊脂平皿法。美國CDC與CLSI推薦用濃度為6 mg/L萬古霉素或5 mg/L替考拉寧的腦心浸液瓊脂平皿篩選。但2006年CLSI就金葡菌對萬古霉素的耐藥折點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)整,中介范圍降至4~8 mg/L,隨著折點(diǎn)的下調(diào),含藥瓊脂平皿篩選法也應(yīng)當(dāng)調(diào)整。本研究用不同濃度萬古霉素和替考拉寧腦心浸液瓊脂進(jìn)行hVISA篩選,同時(shí)以菌群分析/曲線下面積(PAP/ AUC)法[5]作為金標(biāo)準(zhǔn),對比篩選方法靈敏度及特異度,探求耐藥折點(diǎn)變化后hVISA瓊脂平皿合理篩選方案。

      1 材料與方法

      1.1材料

      1.1.1菌株來源 收集山東省15所三級醫(yī)院2014 年3月1日-2015年4月20日分離的MRSA臨床菌株215株,標(biāo)本分別來自痰液125株,血液32株,分泌物58株,依次編號為SA001-SA215,所有菌株均經(jīng)VITEK 2-Compact儀鑒定。質(zhì)控菌株:金葡菌ATCC 29213為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株,標(biāo)準(zhǔn)菌株Mu3(ATCC 700698)購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌收藏所。

      1.1.2儀器與培養(yǎng)基 VITEK全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及比濁儀均為法國生物梅里埃公司生產(chǎn),螺旋涂布儀由中國食品藥品檢定研究院提供,萬古霉素購自禮來公司,MH瓊脂、腦心浸液瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯均為英國OXIOD公司產(chǎn)品。

      1.2檢測方法

      1.2.1PAP/AUC[6]首先配置含系列濃度的萬古霉素腦心浸液瓊脂平皿(BHIV):每 400 mL腦心浸液瓊脂中分別加入0.01 mg/L萬古霉素母液10、20、40、80、100、120、160、320 μL,配制成0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4、8、16 mg/L 8個(gè)濃度的BHIV平皿。挑取血平皿上培養(yǎng)過夜的純菌落,加入到8 mL 胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基,37 ℃空氣浴中振蕩培養(yǎng),24 h后將菌液取出并定義為原液。借助于比濁儀,用無菌生理鹽水將原液分別稀釋為10-3CFU/mL和10-6CFU/mL 2種濃度菌液,用螺旋涂布儀將原液及稀釋菌液分別涂布至上述8個(gè)濃度的BHIV 平皿上。晾干后于37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h。選用3個(gè)不同濃度中單個(gè)菌落生長最好的平皿,采用計(jì)數(shù)圓盤進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),實(shí)際菌落數(shù)應(yīng)為稀釋度乘以該稀釋度下平皿上的菌落數(shù)。利用Graphpad Prism 軟件繪制菌落數(shù)log對數(shù)值對萬古霉素濃度的曲線并計(jì)算AUC。將待測菌株的AUC 與Mu3 的 AUC 進(jìn)行比較。目前公認(rèn)的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為(AUC待測菌株/AUC Mu3比值):萬古霉素敏感金葡菌(VSSA)<0.9;hVISA≥0.9~<1.3;VISA≥1.3。

      1.2.2萬古霉素瓊脂平皿篩選法 2006年CLSI對金葡菌的萬古霉素耐藥折點(diǎn)進(jìn)行了較大的調(diào)整,中介范圍降至4~8 mg/L,敏感范圍為≤2 mg/L,因此,再用含有6 mg/L萬古霉素的腦心浸液瓊脂平皿(BHIV6)篩選hVISA,必將造成篩選的敏感性下降,部分hVISA菌株會(huì)漏檢。本研究認(rèn)為,隨著金葡菌對萬古霉素耐藥折點(diǎn)的下調(diào),hVISA的含藥瓊脂平皿中萬古霉素濃度也要適當(dāng)降低,我們選擇2 mg/L(BHIV2)、4 mg/L(BHIV4) 2個(gè)較低的濃度進(jìn)行篩選,同時(shí)應(yīng)用原來6 mg/L的濃度,對篩選結(jié)果進(jìn)行比對。

      有研究報(bào)道,在含藥平皿中加入16 g/L胰酶消化酪蛋白可以有效提高篩選率[5,7]。因此,本研究在所有瓊脂平皿上均加入該濃度的胰酶消化酪蛋白。以BHIV4為例配置平皿,以腦心浸液瓊脂26 g ,胰酶消化酪蛋白8 g,蒸餾水500 mL的比例配制并高溫高壓滅菌;待冷卻至 45~50 ℃,每500 mL 瓊脂中加入預(yù)溫至50 ℃,2 000 mg/L萬古霉素母液1 mL,即配制成含16 g/L胰酶消化酪蛋白和4 mg/L 萬古霉素的腦心浸液瓊脂平皿,余以此類推。挑取血平皿上培養(yǎng)過夜的純菌落,借助比濁儀,用無菌生理鹽水配置0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木簜溆?。分別取4滴不同濃度的菌液接種于含不同濃度藥物的BHIV上不同部位,35 ℃培養(yǎng)48 h,以48 h至少1滴接種物處有≥2菌落生長為hVISA陽性,以Mu3為陽性對照菌株。

      1.2.3替考拉寧瓊脂平皿篩選法 用含有5 mg/ L替考拉寧腦心浸液瓊脂平皿(BHIT5)篩選是最初篩選hVISA的標(biāo)準(zhǔn)初篩方法,本試驗(yàn)在對比不同濃度萬古霉素平皿篩hVISA的特異度及靈敏度的同時(shí),也對比替考拉寧篩選方法的靈敏度及特異度,觀察耐藥折點(diǎn)調(diào)整后,該方法能否繼續(xù)作為初篩方法。具體方法:挑取血平皿上過夜培養(yǎng)的MRSA純菌落,用0.85 %無菌氯化鈉配制成濁度為2.0麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?,吸?0 μL菌液點(diǎn)種于含有替考拉寧5 mg/L的BHI瓊脂上,室溫晾干后于35 ℃培養(yǎng),24 h和48 h各觀察1次,以48 h時(shí)篩選平皿有≥1個(gè)菌落為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

      2 結(jié)果

      2.1hVISA的PAP/AUC檢測結(jié)果及臨床分離率

      經(jīng)PAP/AUC方法檢測,hVISA陽性菌株為12株,分別為SA012、SA025、SA064、SA077、SA105、SA112、SA118、SA130、SA138、SA165、SA179、SA201,hVISA的分離率為5.6 %。見表1,圖1。

      表1 12株hVISA在不同濃度萬古霉素平皿中菌落形成單位Table 1 Colony-forming units of 12 hVISA strains in presence of different concentrations of vancomycin (CFU/mL)

      圖1 hVISA菌群分析/曲線下面積(PAP/AUC)圖Figure 1 The population analysis profile - area under the curve for identifying hVISA strains

      2.2BHIV平皿篩選結(jié)果

      BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5篩選陽性菌株分別為:6、18、54、20株。

      2.3BHIV平皿法靈敏度和特異度

      以PAP/AUC方法為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算4種含藥平皿篩選法的靈敏度及特異度,見表2。

      表2 4種檢測方法對hVISA的靈敏度及特異度對比Table 2 The sensitivity and specificity of four methods in detecting hVISA strains

      3 討論

      MRSA是醫(yī)院感染重要的病原菌之一,萬古霉素是目前治療MRSA感染的首選藥物,耐藥發(fā)生率較低,但臨床已出現(xiàn)應(yīng)用萬古霉素治療MRSA感染失敗病例,且引起廣泛重視,其中hVISA的發(fā)現(xiàn),可以解釋萬古霉素治療失敗率增加的原因。目前認(rèn)為hVISA是VISA的前體,MRSA原代菌株對萬古霉素敏感,MIC≤2 mg/L,但MRSA原代菌株分裂、繁殖后的菌株中卻含有少量能夠在≥4 mg/L BHIV平皿上生長的亞群,發(fā)生率為10-6,在治療過程中,迫于萬古霉素的壓力這部分耐藥亞群會(huì)逐漸發(fā)展為VISA,導(dǎo)致治療失敗。對hVISA感染檢出率報(bào)道不一,1997-2000年來自亞洲12個(gè)國家的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在1 357株MRSA菌株中,hVISA檢出率為4.3 %,其中來自中國的84株MRSA菌株未檢出hVISA[8]。此后,國內(nèi)對hVISA檢出率陸續(xù)報(bào)道,2007年14個(gè)城市hVISA檢出率為9.5 %[9];部分省份中湖北地區(qū)hVISA檢出率為17.8 %[6],安徽地區(qū)的檢出率為3.5 %[10];本研究通過收集山東省12個(gè)地市15所三級醫(yī)院臨床菌株進(jìn)行檢測,用PAP/AUC方法作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測,最終證實(shí)本地區(qū)hVISA檢出率為5.6 %,略低于全國平均水平,但必須引起足夠重視。

      目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用的紙片擴(kuò)散法、平皿稀釋法無法檢測出hVISA,而且CLSI尚無針對hVISA標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。雖然PAP/AUC法是檢測hVISA的金標(biāo)準(zhǔn),但該法需要特定的儀器及菌株,且較為耗時(shí),無法作為常規(guī)檢測在臨床工作中開展。其他常見的檢測方法還有含藥瓊脂平皿篩選法、宏量E試驗(yàn)法、E試驗(yàn)法等[11],后兩種方法操作較為簡單,也有較高的靈敏度、特異度,但由于需要較多試紙,花費(fèi)較高,無法作為常規(guī)檢測方法在臨床中推廣應(yīng)用。目前應(yīng)用較多、首選的篩選方法仍為含藥腦心浸液瓊脂平皿篩選法。

      隨著2006年CLSI調(diào)整了MRSA對萬古霉素的耐藥折點(diǎn),將萬古霉素中介折點(diǎn)由8~16 mg/L調(diào)整為4~8 mg/L[12]。因此,初篩瓊脂平皿萬古霉素濃度也應(yīng)當(dāng)下調(diào)。

      如何選擇合適的藥物濃度,使得篩選方法有較高的靈敏度及特異度。本研究選擇BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5進(jìn)行hVISA篩選,并以PAP/AUC法作為金標(biāo)準(zhǔn),對比其靈敏度及特異度,觀察最佳指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),BHIV6特異度較高,達(dá)到99.0 %,但靈敏度較差,僅有41.7 %,可造成臨床漏檢。BHIV2雖然靈敏度得到了較大的提高,達(dá) 91.7 %,但假陽性數(shù)較高,特異度偏低,不利于臨床治療方案的調(diào)整。BHIV4和BHIT5結(jié)果顯示有較高的靈敏度和特異度,上述兩種平皿篩選方法檢測結(jié)果與PAP/AUC最終確認(rèn)方法較為一致,雖然靈敏度稍低,但特異度達(dá)到了90 %以上。這2種藥物濃度可以作為hVISA首選的平皿篩選法。同時(shí)為了進(jìn)一步提高檢測方法的靈敏度,建議與其他檢測方法如宏量E試驗(yàn)法等聯(lián)合應(yīng)用,期望盡可能達(dá)到PAP/AUC檢測方法的效果,更好指導(dǎo)臨床治療MRSA感染。同時(shí)從研究結(jié)果上看,上述2種藥物濃度由于假陽性數(shù)較少,因此將初篩結(jié)果再次用E試驗(yàn)檢測時(shí),試紙數(shù)量耗費(fèi)不大,花費(fèi)并不會(huì)太高,更容易被接受。

      [1]P ITZ AM,YU F,HERMSEN ED,et al. Vancomycin susceptibility trends and prevalence of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in clinical methicillin-resistant S. aureus isolates[J]. J Clin Microbiol,2011,49(1):269-274.

      [2]馮娜娜,王琴,宋元林,等. 異質(zhì)性萬古霉素中介的金葡菌感染發(fā)生率及相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J]. 中華內(nèi)科雜志,2013,52(4):318-322.

      [3]劉亞麗,徐英春. 異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌:困擾我們的難題[J]. 中國感染與化療雜志,2013,13(16):495-498.

      [4]VAN HAL SJ,PATERSON DL. Systematic review and metaanalysis of the significance of heterogeneous vancomycinintermediate Staphylococcus aureus isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother,2011,55(1):405-410.

      [5]VAN HAL SJ,WEHRHAHN MC,BARBAGIANNAKOS T,et al. Performance of various testing methodologies for detection of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in bloodstream isolates[J]. J Clin Microbiol,2011,49(4):1489-1494.

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      [9]陳宏斌,王輝,孫聞嘉,等. 2007年中國14個(gè)城市異質(zhì)性萬古霉素中介耐藥的金葡菌分子特征[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,32(11):1223-1227.

      [10]梅清. 安徽地區(qū)異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌的分離率及防耐藥突變濃度的研究[D]. 安徽:安徽醫(yī)科大學(xué),2012.

      [11]許宏濤,陳東科,賴惠英,等. 異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌的分離率調(diào)查及方法學(xué)評價(jià)[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(21):4681-4683.

      [12]Clinical and Laboratory Standard Institute. Performence standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. 22nd informational supplement,2012,M100-S22.

      Effect of updating vancomycin breakpoint for resistant Staphylococcus aureus on plate screening of hetero-resistant vancomycin intermediate Staphylococcus aureus

      LIU Mingtao,LI Kaishu,LI Chao,OUYANG Xiuhe. (Department of Internal Medicine,Binzhou People's Hospital,Binzhou Shandong 256610,China)

      Objective To examine the effect of updating vancomycin breakpoints for resistant Staphylococcus aureus on plate screening of hetero-resistant vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) to find a sensitive and effective plate screening method for detecting hVISA isolates. Methods A total of 215 clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)were collected. The hVISA isolates were identified on the brain heart infusion agar screening plates containing 6 mg/ L vancomycin (BHIV6),4 mg/L vancomycin (BHIV4),2 mg/L vancomycin (BHIV2) and 5 mg/L teicoplanin (BHIT5),respectively. Meanwhile,we also detected hVISA by the population analysis profile/area under the curve (PAP/AUC) method. The PAP/AUC method was taken as the gold standard. We calculated the sensitivity and specificity of BHIV6,BHIV4,BHIV2,BHIT5 screening methods as compared with PAP/AUC method. Results PAP/AUC method identified 12 hVISA strains from the MRSA. BHIV6,BHIV4,BHIV2,and BHIT5 plate screening methods identified 6,18,54,20 hVISA strains,respectively. The sensitivity of these four screening methods was 41.7 %,83.3 %,91.7 %,and 83.3 %,respectively. The corresponding specificity of these methods was 99.0 %,95.9 %,77.8 %,and 94.8 %,respectively. Conclusions After the vancomycin breakpoint for resistant S. aureus is updated,BHIV6 and BHIV2 screening methods are not so valid for detecting hVISA due to lower sensitivity or specificity. BHIV4 and BHIT5 screening methods are still valid for identifying hVISA strains with higher sensitivity and specificity.

      Staphylococcus aureus; vancomycin resistance; laboratory technique and procedure

      R378.11

      A

      1009-7708(2016)04-0455-05

      10.16718/j.1009-7708.2016.04.013

      山東省醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展計(jì)劃(2014WS0310)。

      山東省濱州市人民醫(yī)院內(nèi)科,山東濱州 256610 。

      劉明濤(1984—) 男,醫(yī)學(xué)碩士,主治醫(yī)師,主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制相關(guān)研究。

      歐陽修河,E-mail:842764917@qq.com。

      2015-08-23

      2015-11-18

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