山東半島北岸不同生境潮間帶浮游細菌多樣性研究

王恩輝, 張曉黎, 張 瑩, 龔 駿, 劉東艷, 王玉玨

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山東半島北岸不同生境潮間帶浮游細菌多樣性研究

王恩輝1, 2, 張曉黎1, 張 瑩1, 2, 龔 駿1, 劉東艷1, 王玉玨1

(1. 中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所 海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

通過提取山東半島北岸不同類型潮間帶海水樣品的總DNA, 構(gòu)建16S rDNA文庫, 利用群落相似性分析(ANOSIM)和非度量多維尺度轉(zhuǎn)換排序(NMDS), 探究潮間帶類型對浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的影響, 并對比了與近海浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的差異。分析結(jié)果顯示, 浮游細菌的豐度及多樣性受到潮間帶類型的影響, 煙臺養(yǎng)馬島泥灘、石灘、辛安河沙灘、黃河三角洲堿蓬區(qū)和天鵝湖海草區(qū)以變形菌門占優(yōu)勢, 而黃河三角洲米草區(qū)以擬桿菌門為優(yōu)勢菌, 其中, 天鵝湖海草區(qū)浮游細菌的豐富度和多樣性最高。潮間帶海水中浮游細菌的組成與近海存在顯著差異, 潮間帶浮游細菌的豐度及多樣性均顯著高于近海。推測季節(jié)因素、植被類型、有機質(zhì)來源可能是造成潮間帶不同生境與近海浮游細菌多樣性差異的重要因素。

潮間帶; 浮游細菌; 多樣性; 核糖體DNA

潮間帶生境復(fù)雜, 生物多樣性高, 包括泥灘、沙灘、巖石灘、石沼、紅樹林、海草床等不同類型生態(tài)系統(tǒng)。海洋細菌在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動中發(fā)揮重要作用[1-3]。已有的一些研究發(fā)現(xiàn), 潮間帶細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境中溶解氧、粒度、pH、溫度、營養(yǎng)鹽濃度密切相關(guān)[4-6]; 且潮間帶的植被類型與生長狀況亦影響到細菌群落結(jié)構(gòu)[7-8]。比較而言, 植被群落對潮間帶浮游細菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究相對較少, 且浮游細菌群落組成與潮間帶生境類型的關(guān)系還不甚清楚。因此, 本研究選擇山東半島北岸的泥灘、沙灘、巖石灘、鹽堿植被覆蓋區(qū)、海草床等多種潮間帶類型, 利用細菌16S rDNA克隆文庫及測序等方法, 開展了潮間帶不同生境浮游細菌多樣性特征及群落結(jié)構(gòu)的比較研究, 探究植被覆蓋是否能對潮間帶浮游細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。研究結(jié)果對進一步了解植被群落對海岸帶細菌分布的影響規(guī)律及潮間帶生態(tài)系統(tǒng)功能多樣性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料方法

1.1 研究地點概況與樣品采集

山東半島潮間帶生境類型多樣, 包括泥灘、沙灘、巖石灘、堿蓬區(qū)、米草區(qū)、海草區(qū)、礁石區(qū)等。本次樣品采集于2014年7月山東半島北岸潮間帶及煙臺近海區(qū)域, 具體樣點見圖1, 分別位于養(yǎng)馬島石灘區(qū)(HI-R)、泥灘區(qū)(HI-M), 辛安河沙灘區(qū)(XR-S), 黃河三角洲堿蓬區(qū)(YRD-SU)、米草區(qū)(YDU-SM); 天鵝湖海草區(qū)(SL)以及月亮灣近海(MBO)七個位點。養(yǎng)馬島石灘區(qū)(HI-R)位于煙臺養(yǎng)馬島東南部, 生境內(nèi)多礁石, 分布有小型排污口并緊臨酒店及生活區(qū), 海水受污水排放影響; 泥灘區(qū)(HI-M)位于養(yǎng)馬島西南部, 底質(zhì)為泥質(zhì), 水體較潔凈; 辛安河沙灘(XR-S)位于辛安河河口, 底質(zhì)為細砂, 附近雖然分布有扇貝加工廠及污水處理廠, 但排污口向近海方向延伸較長; 黃河三角洲堿蓬區(qū) (YRD-SU)和米草區(qū)(YDU-SM)受人類活動影響較少,植被覆蓋度較高; 海草區(qū)(SL)位于天鵝湖自然保護區(qū)內(nèi), 海水潔凈, 生物多樣性較高; 月亮灣近海區(qū)(MBO)為旅游區(qū), 受人類活動影響頻繁。于各生境大潮時前后2天內(nèi)到采樣區(qū)域進行樣品采集, 在低潮時利用滅菌采集瓶隨機采集3份表層海水樣品各1 L, 所采集的海水樣品受下層懸浮物影響較小, 并乘船至月亮灣近海用相同方法采集3份表層海水樣品。將3份重復(fù)樣品經(jīng)200 μm孔徑篩絹去除大型藻類和其它雜質(zhì), 分別過濾到0.22 μm孔徑的醋酸纖維脂膜上, 膜樣液氮保存, 用于后續(xù)的分子生物學(xué)實驗。

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴增

利用FastDNA?Spin Kit核酸提取試劑盒(MP Bio, USA)提取膜樣總DNA, 利用微量紫外分光光度計Nanodrop 2000C(Thermo, USA)檢測DNA的濃度和純度。采用細菌16SrDNA通用引物341F (5-CCTACGGGAGGCAGC-3′)和907R(5′-CCGTCA ATTCCTTTG-3′)進行PCR擴增。25 μL擴增體系為: 5×Buffer 5 μL, dNTPs 0.5 μL, Primer 341F 1 μL, Primer 907R 1 μL, 水16.15 μL, Taq酶0.25 μL, 模板DNA 1 μL。PCR擴增條件為: 94預(yù)變性5 min; 94變性30 s, 53退火30 s, 72延伸60 s, 循環(huán)30次; 最后72延伸8 min。

1.3 細菌克隆文庫構(gòu)建及基因序列分析

將每個位點3個重復(fù)的PCR擴增產(chǎn)物合并, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 利用膠純化試劑盒(天根, 中國)純化后, 連接到PTZ57R/T1克隆載體(Ins Taclone PCR Cloning kit, USA)上, 然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌()DH5α感受態(tài)細胞中。將菌液均勻涂布平板, 通過藍白斑篩選, 每個位點樣品挑取約100個克隆子, 利用通用引物M13F/M13R進行PCR擴增, 電泳檢測剔除假陽性, 陽性克隆被送至上海生工測序公司測序。

測序獲得的序列利用BioEdit軟件去除載體序列后, 選取長度為500~600?bp的序列上傳至DECIPHER (Database Enabled Code for Ideal Probe Employing R)網(wǎng)站, 利用在線檢測工具Find Chimera檢測嵌合體[9]。去除嵌合體序列后, 將剩余序列上傳至RDPⅡ (Ribosomal Database Project II)網(wǎng)站, 利用RDP Pipeline在線Aligner功能對序列進行, 其結(jié)果直接利用在線Clust功能確定分類單位(Operation Taxonomic Unit, OTU),序列差異水平為0.03。Clust結(jié)果經(jīng)RDP Analyse Tools計算Chao1及Shannon指數(shù), 并計算各樣品的Rarefaction數(shù)據(jù)[10], 數(shù)據(jù)結(jié)果利用Original 8.0繪圖軟件繪制各樣品的稀疏曲線。同時利用公式=[1–(/)]*100%計算克隆文庫覆蓋率, 其中為只出現(xiàn)一次的克隆子數(shù)目,是文庫中篩選出來的總的陽性序列數(shù)目。

將所獲的16SrDNA序列上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫, 登錄號為:

KR077181-KR077236; KR077242-KR077247; KR077249-KR077311; KR077313-KR077322; KR077324-KR077326; KR077330-KR077334; KR077337-KR077379; KR077382-KR077385; KR077390-KR077415; KR077417-KR077461; KR077464-KR077469; KR077471-KR077474; KR077476-KR077563; KR077565-KR077704; KR077715-KR077726; KR077736-KR077738; KR077741-KR077756; KR077759-KR077762。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

將去除嵌合體后的序列利用RDP Pipeline在線Classified功能, 確定不同生境中微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位, 計算每條序列在不同分類水平上分配到此rank中的概率值, 大于0.8說明到該分類水平的結(jié)果可信[11]。同時利用RDP Pipeline的Formats For Common Progress功能將Clust分類結(jié)果轉(zhuǎn)化, 導(dǎo)出各樣品中OTU分類單元的分布情況, 同時將統(tǒng)計數(shù)據(jù)導(dǎo)入PRIMER 6.0軟件中, 通過對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og(+1)轉(zhuǎn)化, 并利用Bray–Curtis群落相似系數(shù)對樣品進行兩兩比較將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成矩陣形式, 通過非計量多維尺度轉(zhuǎn)換排序(NMDS)工具對所有位點浮游細菌群落結(jié)構(gòu)進行排序, 同時利用軟件包中的ANOSIM 檢驗分析植被覆蓋對潮間帶浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。NMDS分析的可信性通過Kruskal應(yīng)力系數(shù)來計算。應(yīng)力系數(shù)介于0~0.025之間說明擬合度非常好, 介于0.025~0.05之間說明擬合度好, 介于0.05~0.1之間說明擬合度較好。當(dāng)應(yīng)力系數(shù)大于0.2說明擬合結(jié)果較差。

2 結(jié)果

2.1 潮間帶不同生境及近海浮游細菌豐富度和多樣性比較

測序所得序列經(jīng)嵌合體去除, 共獲得534條高質(zhì)量序列, 每個樣品獲得59~91條序列。在0.03的閾值設(shè)定下, 共獲得134個OTU, 每個樣品獲得18~45個OTU(表1)。從圖2上看, 大部分樣品的稀疏曲線已經(jīng)趨于平緩, 雖然有些樣品的稀疏曲線還在上升, 但各克隆文庫覆蓋率均大于70%(表1), 說明克隆文庫的篩選與測序已涵蓋了大部分細菌類群。近海樣品的Chao1與Shannon指數(shù)均低于潮間帶樣品; 在不同生境的潮間帶樣品中, 天鵝湖海草區(qū)的多樣性指數(shù)最高(Chao1=111.4; Shannon=3.48), 而新安河沙灘區(qū)細菌豐富度最低, 但其多樣性指數(shù)相對較高(Chao1=52.55; Shannon=3.21), 養(yǎng)馬島巖石區(qū)細菌多樣性指數(shù)最低, 但其豐富度較高(Chao1= 62.3; Shannon=2.07)(表1)。