Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鑒定及Aβ蛋白表達(dá)檢測(cè)

李　昱，宋貴軍，辛世萌，林璐璐 ，曹云鵬

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116027；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

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Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鑒定及Aβ蛋白表達(dá)檢測(cè)

李昱1，宋貴軍1，辛世萌1，林璐璐1，曹云鵬2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116027；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的探討Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鑒定及蛋白表達(dá)。方法18只12月齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，分別為Ad-Aβ(3-10)10-CpG組，空腺病毒載體組和Aβ1-42組，分別以Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10) 10-CpG鼻黏膜免疫、空腺病毒載體鼻黏膜免疫、Aβ1-42肌內(nèi)注射免疫。各組均每2周免疫1次，共免疫6次。ELISA法檢測(cè)血清抗Aβ抗體滴度及亞型，免疫組化法檢測(cè)免疫后的BALB/c小鼠抗血清能否與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑塊結(jié)合，免疫組化法檢測(cè)鼻黏膜內(nèi)Aβ蛋白的表達(dá)。結(jié)果Ad-Aβ(3-10) 10-CpG組和Aβ1-42組抗體滴度隨著免疫次數(shù)逐漸增加。6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組血清中抗Aβ抗體滴度為(83.71±16.69)μg/mL，明顯高于空載體組(P<0.01)，而低于Aβ1-42組(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組的IgG1/ IgG2a比值分別為10.85±2.02和1.95±1.82，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組IgG1/IgG2a比值明顯高于Aβ1-42組(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組小鼠的抗血清能和轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合。Ad-Aβ(3-10) 10-CpG組鼻黏膜內(nèi)可以檢測(cè)到Aβ蛋白表達(dá)，而其他各組小鼠鼻黏膜內(nèi)未檢測(cè)到Aβ蛋白表達(dá)。結(jié)論Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻黏膜免疫主要產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答，減少了由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)。

阿爾茨海默??；腺病毒載體疫苗；免疫原性；Aβ

[引用本文]李昱，宋貴軍，辛世萌,等.Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鑒定及Aβ蛋白表達(dá)檢測(cè)[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(4)：320-325.

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是導(dǎo)致老年期癡呆的最常見(jiàn)原因。AD的主要病理改變?yōu)槔夏臧吆蜕窠?jīng)原纖維纏結(jié)形成，淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)是老年斑的主要成分。人體淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生Aβ，其中主要為Aβ1-42，AD患者Aβ1-42增多。目前認(rèn)為有神經(jīng)毒性的Aβ聚集是AD發(fā)生和進(jìn)展的始動(dòng)因素[1]。所以AD的治療研究主要集中在減少腦內(nèi)Aβ蛋白沉積和阻斷病理形式Aβ蛋白形成。針對(duì)Aβ蛋白的免疫治療可以減少腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積，并改善轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)和記憶能力[2]。但臨床試驗(yàn)由于6%的病人出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥而被迫停止[3]。這種副作用確切原因不清楚，但是推測(cè)與Aβ的T細(xì)胞抗原決定簇特異性的T細(xì)胞反應(yīng)或傳統(tǒng)佐劑QS21有關(guān)[4]，后續(xù)的主動(dòng)免疫研究集中在改變免疫原和佐劑來(lái)克服不恰當(dāng)?shù)腡細(xì)胞應(yīng)答引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。研究表明在小鼠和人中Aβ分子的B細(xì)胞抗原決定簇定位在Aβ1-15[5-6]，T細(xì)胞抗原決定簇定位在Aβ的中間區(qū)域和C末端[5]。Zago等[7]發(fā)現(xiàn)只有針對(duì)Aβ的N末端的抗體可以使腦內(nèi)淀粉樣斑塊清除。針對(duì)Aβ的N末端的DNA疫苗可以改善轉(zhuǎn)基因鼠認(rèn)知功能，促進(jìn)Aβ斑塊清除，減少腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[8-9]。

本研究前期工作已成功構(gòu)建編碼10次重復(fù)N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG[10]。本研究用該腺病毒載體疫苗通過(guò)鼻黏膜吸入的途徑來(lái)免疫BALB/c鼠，檢測(cè)血清抗Aβ抗體滴度及抗體分型，抗體的功能，鼻黏膜Aβ蛋白表達(dá)，來(lái)檢測(cè)基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG的免疫原性及體內(nèi)Aβ蛋白表達(dá)，為下一步轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

18只BALB/c小鼠均為12月齡，雄性，1只12月齡的APPswe/PSEN1dE9轉(zhuǎn)基因鼠(表達(dá)鼠/人嵌合的淀粉樣蛋白前體和突變的人早老素1，這兩種突變與早發(fā)性AD相關(guān))，雄性，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。隨機(jī)分為3組：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 組、空毒載體組、Aβ1-42組(陽(yáng)性對(duì)照組)，每組6只。所用試劑：Aβ1-42多肽(AnaSpect)，完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，不完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，小鼠單克隆抗體(Covance，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，鼠SP檢測(cè)試劑盒(ZAGB-BIO)，Human Aβ42 ELISA kit (invitrogen)，6E10抗體(Signet，MA)。

1.2方法

1.2.1免疫方法：Ad-Aβ(3-10)10-CpG組：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μL(1×108PFU)鼻腔免疫；空載體組：空腺病毒載體10 μL(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42組：免疫方法參照[2]，Aβ1-42肽干粉1 mg溶于70 μL 1%NH4OH中，再加入430 μL PBS，混勻，每50 μL 分裝。接種前放置37 ℃ 孵育過(guò)夜，第1次免疫用50 μL(100 μg)+完全性弗氏佐劑50 μL，股四頭肌肌內(nèi)注射，第2次及以后免疫用Aβ1-42肽 50 μL(100 μg)+不完全性弗氏佐劑50 μL，股四頭肌肌內(nèi)注射。各組均每2周免疫1次，共免疫6次。

1.2.2血清及臟器標(biāo)本采集：每組小鼠免疫前及第2次到第6次免疫后7天采血，經(jīng)眶靜脈采血，每次采血量約為0.2～0.3 mL；最后一次免疫后2周小鼠處死，經(jīng)髂靜脈及心臟采血，量約1.5 mL。全血室溫下靜置2～3 h，10000 r/min，10 min 離心，留取血清，分裝，-70 ℃ 保存。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組、空載體組留取3只小鼠的鼻子，放入含有EDTA的75%乙醇-甲醛中脫鈣固定3周。

1.2.3ELISA 法測(cè)血清抗Aβ 抗體滴度和亞型：ELISA法檢測(cè)免疫前及第2次到第6次免疫后7天的血清中抗Aβ抗體水平。用碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6，0.05 mol/L)將Aβ1-42肽稀釋至5 μg/mL，在96孔酶標(biāo)板每個(gè)孔中加0.1 mL，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液(含0.05%TW20的1×PBS)洗板3次。每孔中加入封閉緩沖液(含0.5%BSA，5%羊血清，0.05%TW20的1×PBS)200 μL，室溫孵育1 h。棄去孔中液體，向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)抗體6E10(標(biāo)準(zhǔn)抗體濃度分別為10 ng/mL，7.5 ng/mL，5 ng/mL， 2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.625 ng/mL，0 ng/mL)和待測(cè)血清(血清稀釋500～3000倍)50 μL，置于37 ℃孵育1.5 h。棄去血清和抗體，用洗滌緩沖液洗板3次。于各孔中加入稀釋羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶1000稀釋)，IgG1-HRP(1∶500稀釋)，IgG2a-HRP(1∶500稀釋), IgG2b-HRP(1∶500稀釋) 0.1 mL，置于37 ℃ 孵育1 h。棄去二抗，洗板5次。于各孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，置于37 ℃ 孵育20 min。于各反應(yīng)孔中加入0.5 mol/L硫酸0.1 mL。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各待測(cè)血清中的抗Aβ 抗體濃度。

1.2.4抗血清對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠腦中淀粉樣斑塊免疫反應(yīng)性的檢測(cè)：1只12月齡的APPswe/PSEN1dE9轉(zhuǎn)基因鼠處死，右側(cè)大腦半球以75%乙醇-甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，冠狀位切片，厚度約為4 μm。常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min→100%酒精Ⅰ5 min→ 100%酒精Ⅱ5 min→95%酒精5 min→80%酒精5 min→75%酒精5 min，蒸餾水洗5次。3%雙氧水37 ℃，孵育10 min，以阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次，每次5 min。置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修復(fù)，自然冷卻20 min以上，冷水沖洗，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加正常羊血清工作液封閉，37 ℃，10 min。滴加一抗，分別滴加Ad-Aβ(3-10)10-CpG組小鼠免疫前，6次免疫后的血清，Aβ1-42組6次免疫后血清，空載體組6次免疫后血清，4 ℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記相應(yīng)的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min；DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染5 min，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹(shù)膠封片。

1.2.5鼻黏膜中Aβ蛋白表達(dá)的檢測(cè)：免疫治療后1周，將用含EDTA的75%乙醇-甲醛中脫鈣固定后的Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和空載體組小鼠的鼻子常規(guī)石蠟包埋，按平行鼻腔長(zhǎng)軸方向切片，厚約4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%雙氧水37 ℃孵育10 min以阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修復(fù)，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封閉，37 ℃，10 min，傾去勿洗；檢測(cè)小鼠鼻黏膜Aβ表達(dá)，滴加6E10抗體(1∶500 稀釋)，滴加生物素標(biāo)記相應(yīng)的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染5 min，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹(shù)膠封片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS16.0軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1血清抗Aβ抗體滴度及分型

各組免疫前的血清未檢測(cè)到抗Aβ抗體，隨著免疫次數(shù)增加，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組抗體滴度逐漸增加，而空載體組抗體滴度一直呈基線水平。第6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組血清中抗Aβ抗體滴度平均值分別為(83.71±16.69)μg/mL和(103.5±18.94)μg/mL，明顯高于空載體組(P<0.01)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組血清抗Aβ抗體滴度低于Aβ1-42組(P<0.05)。見(jiàn)圖 1。將Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組第6次免疫后的血清進(jìn)行抗體亞型分析。產(chǎn)生的抗體有IgG1，IgG2a，IgG2b，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組產(chǎn)生的抗體主要為IgG1，IgG1/ IgG2a比值為10.85±2.02；Aβ1-42組的IgG1/IgG2a比值為1.95±1.82。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組IgG1/IgG2a比值明顯高于Aβ1-42組(P<0.05)。見(jiàn)圖 2。

圖1　免疫過(guò)程中各組小鼠血清中抗Aβ抗體滴度變化Fig 1 Anti-Aβ antibody titers in the sera of mice of three groups　　　與空載體組比較，* P<0.05，** P<0.01；# 與Aβ1-42組比較，P<0.05

圖2　血清抗Aβ抗體亞型分析Fig 2 Isotype analysis of anti-Aβ antibodyA：第6次免疫后血清抗Aβ抗體的IgG1，IgG2a，IgGb亞型；B：IgG1/IgG比值。*與Aβ1-42組比較，P<0.05

2.2抗血清和轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊結(jié)合反應(yīng)

6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組小鼠的抗血清都能和轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合，而Ad-Aβ(3-10)10-CpG組免疫前的血清和空載體組的血清不能與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合而使其顯色(圖3)。

圖3　小鼠血清與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑塊結(jié)合反應(yīng)Fig 3 The reaction of sera from each group to Aβ plaques in brain of transgenic mice (APPswe/PSEN1dE9)　　A：Ad-Aβ(3-10)10-CpG組免疫前血清；B：Aβ1-42組抗血清；C：Ad-Aβ(3-10)10-CpG組抗血清；D：空載體組血清。B和C能與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑塊結(jié)合；A和D不能與Aβ斑塊結(jié)合。圖中比例尺代表100 μm

2.3Aβ蛋白在鼻黏膜中的表達(dá)

免疫治療后1周Ad-Aβ(3-10)10-CpG組小鼠鼻腔上皮細(xì)胞可以觀察到被Aβ抗體染成棕色的Aβ蛋白表達(dá)，而空載體組小鼠未觀察到Aβ蛋白表達(dá)(圖4)。

3　討　論

研究表明，包含Aβ N末端片段的肽類疫苗[11]，和基因疫苗[9,12-13]可以有效減輕AD樣病理改變，而不會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細(xì)胞浸潤(rùn)。Mclaurin等[6]分析Aβ肽N末端多個(gè)小肽段認(rèn)為Aβ4-10是與抗Aβ抗體結(jié)合的最小肽段，Aβ3-6為抗Aβ積聚的抗原決定簇，缺少3號(hào)位氨基酸時(shí)其與抗Aβ抗體的親和性明顯降低。因此，本研究選擇Aβ3-10作為的腺病毒疫苗編碼的抗原。在人類，CpG序列直接刺激B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞。CpG序列可以用作疫苗的佐劑，來(lái)增加疫苗特異性免疫應(yīng)答的速度，程度和持續(xù)時(shí)間[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，包含CpG序列的空載體可以減輕自身免疫性腦膜炎[15]。CpG-ODN作為佐劑可以增強(qiáng)DNA初始-蛋白加強(qiáng)免疫策略時(shí)大鼠體內(nèi)抗Aβ抗體的產(chǎn)生，而且產(chǎn)生的免疫反應(yīng)為Th2型[16]。所以，本組前期研究將Aβ的N末端片段縮小到Aβ3-10并重復(fù)10次，以CpG序列為佐劑，構(gòu)建新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證[10]。

圖4　免疫后1周Ad-Aβ(3-10)10-CpG組小鼠鼻腔上皮細(xì)胞Aβ蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of Aβ in nasal epithelial cells one week after immunization　　A：良好分化的柱狀上皮；B：上皮損壞暴露的立方形、基底樣細(xì)胞。均檢測(cè)到被Aβ抗體染成棕色的Aβ蛋白表達(dá)。比例尺代表50 μm

本研究發(fā)現(xiàn)Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗鼻黏膜免疫可以在鼻黏膜表達(dá)Aβ蛋白。腺病毒疫苗鼻黏膜免疫7天后，可以在嗅球，嗅神經(jīng)細(xì)胞層，嗅神經(jīng)纖維觀察到轉(zhuǎn)基因蛋白的表達(dá)[17]。腺病毒載體可以通過(guò)鼻黏膜的嗅神經(jīng)細(xì)胞逆行性轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗鼻黏膜免疫可以在鼻黏膜上皮表達(dá)Aβ蛋白，也可以通過(guò)相同途徑入腦，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗Aβ抗體，進(jìn)而清除腦內(nèi)Aβ斑塊。

本研究中Ad-Aβ(3-10)10-CpG 組6次免疫后產(chǎn)生的抗Aβ抗體滴度明顯高于空載體組，但是低于Aβ1-42組，這與以往的基因疫苗研究結(jié)果相似[18]。免疫球蛋白亞型間接反映免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞因子主要誘導(dǎo)IgG1產(chǎn)生，Th1細(xì)胞因子主要誘導(dǎo)IgG2a產(chǎn)生[18]。從免疫球蛋白IgG亞型分析可以看出，Ad-Aβ(3-10)10-CpG 組主要產(chǎn)生的抗體為IgG1型，說(shuō)明主要產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答，而Aβ1-42組同時(shí)產(chǎn)生IgG1和IgG2a型，說(shuō)明同時(shí)產(chǎn)生了Th1和Th2型應(yīng)答。所以Ad-Aβ(3-10)10-CpG與Aβ42疫苗相比引起Th1免疫應(yīng)答相關(guān)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)可能性更小，更安全。而且，既往研究也表明IgG1比IgG2a和IgG2b清除腦內(nèi)Aβ斑塊更有效[19]。

研究表明，抗Aβ抗體阻止Aβ聚集或促進(jìn)Aβ解聚是通過(guò)直接與Aβ沉積結(jié)合破壞β片層結(jié)構(gòu)而引起斑塊解聚[20]，進(jìn)一步與可溶性Aβ結(jié)合來(lái)保護(hù)突觸功能并減少Tau蛋白磷酸化[7]。本研究中Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組免疫后的抗血清能與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合，說(shuō)明Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗產(chǎn)生的抗體能夠促進(jìn)腦內(nèi)Aβ斑塊清除，對(duì)AD有治療作用。

綜上所述，Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻黏膜免疫BLAB/c鼠可以誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，不引起明顯的炎癥反應(yīng)，因此Ad-Aβ(3-10)10-CpG是一種安全有效的治療AD的候選疫苗。

[1] Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002, 297 (5580): 353-356.

[2] Janus C, Pearson J, McLaurin J, et al. A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease[J]. Nature,2000, 408 (6815): 979-982.

[3] Orgogozo JM, Gilman S, Dartigues JF, et al. Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization[J]. Neurology,2003, 61 (1): 46-54.

[4] Nicoll JA, Wilkinson D, Holmes C, et al. Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide: a case report[J]. Nat Med,2003, 9 (4): 448-452.

[5] Cribbs DH, Ghochikyan A, Vasilevko V, et al. Adjuvant-dependent modulation of Th1 and Th2 responses to immunization with beta-amyloid[J]. Int Immunol,2003, 15 (4): 505-514.

[6] McLaurin J, Cecal R, Kierstead ME, et al. Therapeutically effective antibodies against amyloid-beta peptide target amyloid-beta residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis[J]. Nat Med, 2002, 8 (11): 1263-1269.

[7] Zago W, Buttini M, Comery TA, et al. Neutralization of soluble, synaptotoxic amyloid β species by antibodies is epitope specific[J]. J Neurosci, 2012, 32 (8): 2696-2702.

[8] Xing XN, Sha S, Chen XH, et al. Active Immunization with DNA Vaccine Reduced Cerebral Inflammation and Improved Cognitive Ability in APP/PS1 Transgenic Mice by In Vivo Electroporation[J]. Neurochem Res, 2015, 40 (5): 1032-1041.

[9] Sha S, Xing XN, Cao YP. Active immunotherapy facilitates Aβ plaque removal following through microglial activation without obvious T cells infiltrating the CNS[J]. J Neuroimmunol, 2014, 274 (1-2): 62-70.

[10] Li Y, Ma Y, Zong LX, et al. Intranasal inoculation with anadenovirus vaccine encoding ten repeats of Aβ3-10 induces Th2 immune response against amyloid-β in wild-type mouse[J]. Neurosci Lett, 2011, 505 (2): 128-33.

[11] Seabrook TJ, Thomas K, Jiang L, et al. Dendrimeric Abeta1-15 is an effective immunogen in wildtype and APP-tg mice[J]. Neurobiol Aging, 2007, 28 (6): 813-823.

[12] Movsesyan N, Ghochikyan A, Mkrtichyan M, et al. Reducing AD-like pathology in 3xTg-AD mouse model by DNA epitope vaccine - a novel immunotherapeutic strategy[J]. PLoS ONE, 2008, 3 (5): e2124.

[13] Zou J, Yao Z, Zhang G, et al. Vaccination of Alzheimer's model mice with adenovirus vector containing quadrivalent foldable Abeta(1-15) reduces Abeta burden and behavioral impairment without Abeta-specific T cell response[J]. J Neurol Sci,2008, 272 (1-2): 87-98.

[14] Klinman DM, Klaschik S, Tomaru K, et al. Immunostimulatory CpG oligonucleotides: Effect on gene expression and utility as vaccine adjuvants[J]. Vaccine, 2010, 28 (8): 1919-1923.

[15] Matsumo Y, Sakuma H, Miyakoshi A, et al. Characterization of relapsing autoimmune encephalomyelitis and its treatment with decoy chemokine receptor genes[J]. J Neuroimmunol, 2005, 170 (1-2): 49-61.

[16] Subramanian S, Divya Shree AN. Enhanced Th2 immunity after DNA prime-protein boost immunization with amyloid beta (1-42) plus CpG oligodeoxynucleotides in aged rats[J]. Neurosci Lett, 2008, 436 (2): 219-222.

[17] Kaufman DR, Bivas-Benita M, Simmons NL, et al. Route of adenovirus-based HIV-1 vaccine delivery impacts the phenotype and trafficking of vaccine-elicited CD8+T lymphocytes[J]. J Virol, 2010, 84 (12): 5986-5996.

[18] Lambracht-Washington D, Qu BX, Fu M, et al. DNA beta-amyloid(1-42) trimer immunization for Alzheimer disease in a wild-type mouse model[J]. JAMA, 2009, 302 (16): 1796-1802.

[19] Chauhan NB, Siegel GJ. Efficacy of anti-Abeta antibody isotypes used for intracerebroventricular immunization in TgCRND8[J]. Neurosci Lett, 2005, 375 (3): 143-147.

[20] Solomon B, Koppel R, Frankel D, et al. Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (8): 4109-4112.

Identification of the immunogenicity of multivalence Aβ3-10adenovirus vaccine and expression of Aβ in nasal mucosal in BALB/c mice

LI Yu1, SONG Gui-jun1, XIN Shi-meng1, LIN Lu-lu1, CAO Yun-peng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China；2.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To identify the immunogenicity of the multivalence Aβ3-10adenovirus vaccine and to detect the expression of Aβ in nasal mucosa of the BALB/c mice. Methods Eighteen twelve-month old BALB/c mice were divided into three groups, Ad-Aβ(3-10)10-CpG group, empty vector group and Aβ1-42group. They were immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG by intranasal inoculation, with intranasal inoculation empty adenoviral vector and with intramuscularly injection Aβ1-42, respectively. Titers of anti-Aβ antibody and isotypes of immunoglobin in sera were determined with ELISA. The immunoreactivity of antisera to amyloid plaque and the expression of Aβ in nasal mucosal were detected by immunohistochemistry. Results Sera from Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42group showed a steady increase in anti-Aβ antibody titer with each boost. The average anti-Aβ antibody titer in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group (83.71±16.69)μg/mL after six times of immunization was greater than that in empty vector group(P<0.01)and lower than that in Aβ1-42group(P<0.05). IgG1/IgG2a ratio was 10.85±2.02 in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and 1.95±1.82 in Aβ1-42group(P<0.05). Sera from Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42group was able to bind to Aβ plaques in brain sections of transgenic mouse. Expression of Aβ in the nasal mucosa was observed in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group, while not in other groups. Conclusions Intranasal inoculation with the recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG could induce Th2-polarized immune response in the wild-type mice. The adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause T cell-mediated autoimmune response. This could provide the basis for the next step researches in transgenic mice.

Alzheimer's disease; adenovirus vaccine; immunogenicity； β-amyloid

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81371227)

李 昱(1983-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，主治醫(yī)師。E-mail: liyu_cmu@hotmail.com

曹云鵬，教授。E-mail: ypengcao@yahoo.com

論著10.11724/jdmu.2016.04.02

R741.05

A

1671-7295(2016)04-0320-06

2016-06-13；

2016-07-06)