鼠李糖脂產(chǎn)生菌M7-6在模擬油藏條件下的培養(yǎng)基優(yōu)化

郭　超，趙　峰，鄭甜甜，史榮久，韓斯琴，崔慶峰，張　穎

（1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110016；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.中國石油勘探開發(fā)研究院廊坊分院滲流流體力學(xué)研究所，河北廊坊065007）

鼠李糖脂產(chǎn)生菌M7-6在模擬油藏條件下的培養(yǎng)基優(yōu)化

郭超1，2，趙峰1，鄭甜甜1，2，史榮久1，韓斯琴1，崔慶峰3，張穎1

（1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110016；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.中國石油勘探開發(fā)研究院廊坊分院滲流流體力學(xué)研究所，河北廊坊065007）

基于已篩選出的鼠李糖脂產(chǎn)生菌M7-6，在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下，對該菌株的激活劑配方進(jìn)行了碳源、氮源、碳氮比（C/N）、無機(jī)鹽等因素的優(yōu)化，并考察了該菌株在模擬油藏條件下的最佳接種量；利用厭氧發(fā)酵罐對菌株M7-6進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)，評價(jià)菌M7-6的原位代謝活性及與其他微生物類群的競爭作用。結(jié)果表明:以甘油為碳源、硝酸鹽為氮源、C/N為14.4∶1時(shí)，最利于菌株M7-6在模擬油藏條件下生產(chǎn)鼠李糖脂，最小接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)）。在厭氧發(fā)酵罐中，菌株M7-6可以將培養(yǎng)體系的表面張力降至38.4 mN/m；并且體系中烴降解菌和產(chǎn)酸菌數(shù)量有所增加，而硫酸鹽還原菌數(shù)逐漸減少。

鼠李糖脂；模擬油藏條件；厭氧激活劑；微生物采油

生物表面活性劑是由微生物生產(chǎn)的一類具有表面活性的物質(zhì)，主要包括糖脂、脂肽以及中性磷脂等［1-4］。生物表面活性劑能有效降低油水界面張力、乳化原油、增溶和改變分子極性，在石油開采領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力［5-8］。目前，關(guān)于利用生物表面活性劑進(jìn)行微生物驅(qū)油（microbial enhanced oil recovery，MEOR）的實(shí)驗(yàn)室模擬研究和現(xiàn)場研究，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道［9-13］。

研究報(bào)道的生物表面活性劑產(chǎn)生菌絕大多數(shù)為好氧菌，在油藏缺氧環(huán)境下無法生存或不能產(chǎn)表面活性劑［14］。在微生物采油應(yīng)用中，或者在地面發(fā)酵生產(chǎn)表活劑產(chǎn)品，或者需要向地下注入空氣來維持其原位合成代謝活性，都存在成本高、操作性差、效果不穩(wěn)定等問題［15］，限制了好氧表面活性劑產(chǎn)生菌的應(yīng)用。而厭氧表面活性劑產(chǎn)生菌能夠在缺氧條件下產(chǎn)生表面活性劑，如果實(shí)現(xiàn)將菌種及其營養(yǎng)液注入油藏，使該微生物在油藏原位條件下生產(chǎn)表面活性劑來提高原油采收率，將在微生物采油應(yīng)用中具有更廣闊的應(yīng)用前景［16］。

針對目標(biāo)油藏，在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下，對厭氧表面活性劑產(chǎn)生菌進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，可以提高菌株在油藏原位的表面活性劑產(chǎn)量，進(jìn)而增強(qiáng)菌株的驅(qū)油效率。本研究中，筆者以實(shí)驗(yàn)室篩選的厭氧產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑的菌株M7-6為研究對象，在模擬新疆油田油藏條件下，對菌株M7-6的營養(yǎng)激活劑配方進(jìn)行篩選與優(yōu)化。利用厭氧發(fā)酵罐對菌株M7-6進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，評價(jià)其最優(yōu)培養(yǎng)基，并監(jiān)測厭氧發(fā)酵罐中特定功能微生物類群及數(shù)量變化，為基于該菌株的微生物驅(qū)油現(xiàn)場試驗(yàn)提供室內(nèi)評價(jià)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）M7-6由筆者所在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離和保存，該菌株能夠在厭氧條件下生產(chǎn)鼠李糖脂。

1.1.2培養(yǎng)基

1）基礎(chǔ)厭氧培養(yǎng)基（g/L）［17］:甘油46.55、NaNO33.00、K2HPO4·3H2O 5.25、KH2PO45.71、MgSO4·7H2O 0.40、CaCl20.13、KCl 1.0，NaCl 1.0、酵母提取物2.69，所用水為油田采出水。

2）計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基

①硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基（g/L）:乳酸鈉4.0、酵母膏1.0、MgSO4·7 H2O 0.2、NaCl 10.0、KH2PO40.5、維生素C 0.1。

②產(chǎn)酸菌培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、葡萄糖10 g/L、乳糖10 g/L、蔗糖10 g/L、2 g/L溴甲酚紫1～2 mL；pH 7.2～7.3，固體培養(yǎng)基加入瓊脂。

③烴降解菌培養(yǎng)基（g/L）:尿素1.0、KNO31.0、NH4Cl 1.0、KH2PO42.0、Na2HPO43.0、MgSO4·7H2O 0.2、CaCl20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；每升培養(yǎng)基中加微量元素液9 mL、維生素液5 mL。

3）菌體活化培養(yǎng)基選用LB液體培養(yǎng)基。

1.1.3主要儀器

Biofuge Primor型低溫離心機(jī)，美國Thermo公司；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FLC-3型超凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)公司；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BZY-1型全自動表面張力儀，上海衡平儀器儀表廠；360EMC型厭氧發(fā)酵罐，英國Electrolab公司。

1.2方法

1.2.1測定方法與種子液制備

微生物計(jì)數(shù)方法:采用平板涂布計(jì)數(shù)法和最大或然數(shù)（most probable number，MPN）計(jì)數(shù)法［18-19］。菌體干質(zhì)量測定方法:將樣品在5 000 r/min條件下離心10 min后，收集菌體，將其干燥至恒質(zhì)量，稱量。表面張力測定:樣品5 000 r/min條件下離心10 min后，上清液的表面張力值利用BZY1型全自動表面張力儀進(jìn)行測定。

1.2.2碳源優(yōu)化

選取葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜、大豆油等常用碳源進(jìn)行評價(jià)［17］。以基礎(chǔ)厭氧培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行碳源的單因素分析實(shí)驗(yàn)。分別取含有不同碳源的培養(yǎng)基18 mL接入到25 mL厭氧管中，將菌株M7-6種子液離心，等體積生理鹽水重懸后，以5%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入?yún)捬豕苤小Ｃ總€(gè)實(shí)驗(yàn)組合設(shè)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取三者的平均值。厭氧管于39℃下靜置培養(yǎng)7 d后，取樣測定其排油圈直徑與表面張力，確定最佳碳源。

1.2.3氮源優(yōu)化

基于筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究成果［15-17］，分別以玉米漿粉、NaNO3、蛋白胨為待考察氮源，進(jìn)行氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。利用上述獲得的最佳碳源作為碳源，分別使用以上氮源代替基礎(chǔ)厭氧培養(yǎng)基中原有氮源，其他成分不變。將18 mL含不同氮源的培養(yǎng)基分裝到25 mL的厭氧管中；其他處理同碳源優(yōu)化。7 d后取樣并測定其排油圈直徑和表面張力，確定最佳氮源。

1.2.4碳氮比的選擇

在最佳碳源和最佳氮源確定之后，將已獲得的最佳碳源和最佳氮源，設(shè)置4∶1、8∶1、12∶1、14.4∶1、16∶1、20∶1、25∶1和30∶1的質(zhì)量比例組合，在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下，篩選菌株生產(chǎn)鼠李糖脂的最適碳氮比。將8種不同碳氮比的培養(yǎng)基各取18 mL加入25 mL厭氧管中；接種5% M7-6菌體的生理鹽水重懸液，并設(shè)定3組平行，39℃下厭氧靜置培養(yǎng)，7 d后取樣測定其排油圈直徑與表面張力，確定最適碳氮比。

1.2.5最適無機(jī)鹽

在確定最佳碳源、氮源及碳氮比后，研究2種無機(jī)鹽緩沖對（鈉鹽緩沖對、鉀鹽緩沖對）以及MgSO4的有無對菌株M7-6在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下產(chǎn)鼠李糖脂的影響。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組A（無鈉、鉀緩沖對）、B（Na2HPO4與NaH2PO4緩沖對）和C（K2HPO4與KH2PO4緩沖對）3組緩沖對實(shí)驗(yàn)。確定最佳無機(jī)鹽緩沖體系后，其他成分不變；又設(shè)置實(shí)驗(yàn)組D（不添加MgSO4）和E（添加MgSO4）2組實(shí)驗(yàn)。接種量與培養(yǎng)條件等同碳源優(yōu)化，培養(yǎng)第7天后，取樣測定排油圈直徑和表面張力，確定最適緩沖對以及MgSO4的取舍。

1.2.6最佳接種量的選擇

用新疆油田采出水配制以上獲得的最佳培養(yǎng)基，在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下，研究不同接種量對菌株M7-6產(chǎn)鼠李糖脂的影響，分別設(shè)置接種量為0.001%、0.01%、0.1%、1%和5%（體積分?jǐn)?shù)）的5組實(shí)驗(yàn)，39℃下厭氧靜置培養(yǎng)7 d后，取樣測定各實(shí)驗(yàn)組的排油圈直徑和表面張力，確定最適接種量。

1.2.7發(fā)酵罐試驗(yàn)

以新疆油田采出水配制上述獲得的最優(yōu)培養(yǎng)基4 L，在6 L的厭氧發(fā)酵罐中對鼠李糖脂產(chǎn)生菌株M7-6進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，評價(jià)該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度設(shè)為39℃，培養(yǎng)周期為15 d，每天取樣測定菌體干質(zhì)量、表面張力、排油圈直徑和發(fā)酵液的原油乳化效果。在培養(yǎng)的第7天和第15天，測定硫酸鹽還原菌、產(chǎn)酸菌和烴降解菌等與采油密切相關(guān)菌群的變化，從而了解菌株M7-6的競爭能力及所獲得的最優(yōu)培養(yǎng)基對本源功能微生物的激活情況。

鼠李糖脂產(chǎn)量測定方法［20］:將2 mL樣品在5 000 r/min條件下離心10 min后，取上清液10 μL，測定其排油圈直徑，以排油圈直徑作為鼠李糖脂產(chǎn)量的間接表征。乳化性能測定［21］:取3 mL原油和3 mL菌株M7-6厭氧發(fā)酵液加入到帶刻度試管中，渦旋振蕩2 min，靜置24 h，測定乳化系數(shù)EI24: EI24=（有機(jī)相高度/混合物總高度）×100%。

M7-6種子液制備:在已滅菌的超凈工作臺中，使用接種環(huán)，從M7-6菌株的斜面上，刮取一環(huán)M7-6菌體，并接種到裝有100 mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在39℃、180 r/min條件下好氧培養(yǎng)24 h。

2　結(jié)果與討論

2.1碳源對M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響

考察不同碳源對M7-6厭氧發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:以甘油為碳源，菌株M7-6可將發(fā)酵液表面張力從64.9 mN/m降至32.7 mN/m，是所考察的6種碳源中表面張力降低幅度最大的。然而，甘油和大豆油的排油圈直徑均明顯高于其他碳源，排油圈直徑可以間接地反映菌株M7-6的鼠李糖脂產(chǎn)量。但是，以大豆油為碳源時(shí)，表面張力降低并不明顯，并且大豆油與原油具有相似相容特性，所以，在取樣過程中取出的少許大豆油殘余會對后續(xù)排油圈直徑的測定有很大的影響，導(dǎo)致排油圈直徑偏大。此外，大豆油為疏水性碳源，在培養(yǎng)基中溶解不均勻，缺氧條件下也不易于菌體的吸收利用。然而，甘油可以與水以任意配比互溶，且菌體利用效率高，菌體對甘油的代謝也不受溶解氧的限制［22-23］。因此，甘油更利于菌株M7-6在缺氧條件下代謝生產(chǎn)鼠李糖脂。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇甘油作為菌株M7-6在模擬油藏條件下生產(chǎn)鼠李糖脂的碳源。

圖1　碳源對菌株M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.1 Effects of carbon source on anaerobic production of rhamnolipid by strain M7-6

2.2氮源對M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響

考察不同氮源對M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出:以NaNO3作為氮源時(shí)，菌株M7-6發(fā)酵液表面張力下降幅度最大，可從60 mN/m下降至27 mN/m。考察的3種氮源中，以NaNO3為氮源的發(fā)酵液排油圈直徑最大，達(dá)到了15 mm。在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下，缺氧導(dǎo)致菌體為了生長代謝，而進(jìn)行厭氧呼吸。硝酸鹽可以作為細(xì)菌在厭氧條件下生長代謝的電子受體，維持菌株在厭氧條件下的生長和生產(chǎn)鼠李糖脂。因此，以硝酸鹽為氮源時(shí)，發(fā)酵液的表面張力降低幅度最大，且排油圈直徑也最大。并且，也有很多文獻(xiàn)報(bào)道硝酸鹽是生物表面活性劑生產(chǎn)的最優(yōu)氮源［24-26］。綜合上述因素，選擇NaNO3作為菌株M7-6在模擬油藏條件下生產(chǎn)鼠李糖脂的最適氮源。

圖2　氮源對菌株M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.2 Effects of nitrogen source on anaerobic production of rhamnolipid by strain M7-6

2.3碳氮比（C/N）選擇

以甘油和NaNO3為最優(yōu)碳源和氮源，進(jìn)行了菌株M7-6培養(yǎng)基的碳氮比優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)C/N為14.4∶1時(shí)，菌株M7-6可將發(fā)酵液的表面張力降至30 mN/m以下，并且排油圈直徑可以達(dá)到30 mm。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加氮源的量（減小碳氮比），菌株產(chǎn)鼠李糖脂的變化幅度并不明顯。合適的C/N對鼠李糖脂的合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。據(jù)文獻(xiàn)［27-28］報(bào)道，限制氮源，更利于鼠李糖脂的生產(chǎn)。培養(yǎng)基中氮源被耗盡時(shí)，由氮決定的生物合成便受到限制，然而，碳源仍可以源源不斷地運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)部，用于生物合成次生代謝產(chǎn)物鼠李糖脂［28］。但是，在厭氧條件下，菌體的生長代謝需要一定量的硝酸鹽（氮源）作為電子受體。因此，對于厭氧產(chǎn)鼠李糖脂來說，氮源的量既不能太高，也要滿足菌體厭氧呼吸的需要。綜上所述，選擇14.4∶1作為菌株M7-6在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下的最優(yōu)碳氮比。

圖3　碳氮比對菌株M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.3 Effects of the C/N ratio on anaerobic production of rhamnolipid by strain M7-6

2.4無機(jī)鹽的優(yōu)化

為進(jìn)一步簡化所獲得的培養(yǎng)基，在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了無機(jī)鹽優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:Na2HPO4與NaH2PO4緩沖對在表面張力降低和鼠李糖脂產(chǎn)量方面都略好于K2HPO4與KH2PO4緩沖對，可能是Na+對菌株產(chǎn)生鼠李糖脂的過程更有利一些，且兩者的價(jià)格相當(dāng)，所以，選擇Na2HPO4與NaH2PO4緩沖對作為最適的無機(jī)鹽緩沖對。由圖4還可以看出，MgSO4·7H2O的添加與否對表面張力影響較小，二者的表面張力值均在30 mN/m以下。但是，對鼠李糖脂的產(chǎn)量有較大的影響，兩者的排油圈直徑差值達(dá)到了19 mm，這說明MgSO4·7H2O是菌株生產(chǎn)鼠李糖脂的關(guān)鍵因子，不可簡化。

圖4　無機(jī)鹽對菌株M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.4 Effects of mineral salt on anaerobic production of rhamnolipid by strain M7-6

2.5接種量對M7-6的影響

除培養(yǎng)基外，接種量的大小同樣是影響菌株發(fā)酵效果的重要因素之一，接種量對M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知:接種量為0.001%和0.01%的實(shí)驗(yàn)組，既沒有明顯的表面張力降低，也沒有較好的鼠李糖脂產(chǎn)量。說明在較低的接種量下，菌株M7-6的生長差，產(chǎn)生鼠李糖脂較少。接種量為0.1%的實(shí)驗(yàn)組在鼠李糖脂產(chǎn)量和表面張力降低方面有較大提升，但距離預(yù)期值仍有一定差距。接種量為1%和5%的實(shí)驗(yàn)組表面張力可降至30 mN/m以下，且鼠李糖脂產(chǎn)量明顯優(yōu)于0.1%接種量的實(shí)驗(yàn)組，排油圈直徑可達(dá)30 mm。由于接種量為1%和5%的實(shí)驗(yàn)組之間的鼠李糖脂產(chǎn)量相當(dāng)，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，選取1%作為菌株M7-6在模擬油藏條件下產(chǎn)鼠李糖脂的最適接種量。

2.6厭氧發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)，最終確定菌株M7-6在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度及缺氧）下的最優(yōu)培養(yǎng)基配方（g/L）:甘油70.3、NaNO34.87、Na2HPO4·3H2O 6.9、NaH2PO45.49和MgSO4·7H2O 0.4。菌株的最小接種量為1%?；谝陨蠑?shù)據(jù)，對菌株M7-6進(jìn)行了厭氧發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

由圖6可知:發(fā)酵液的表面張力在第5天達(dá)到了最低值38.4 mN/m，但并未達(dá)到在厭氧管中的效果，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)體系擴(kuò)大之后，對菌體造成了一些不穩(wěn)定影響，例如:熱量傳遞和質(zhì)量傳遞慢，局部位置更容易形成與整體不同的微環(huán)境等因素，都可能對菌株產(chǎn)生鼠李糖脂有不利影響。

圖5　接種量對M7-6厭氧產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.5 Effects of the inoculum amount on anaerobic production of rhamnolipid by strain M7-6

圖6　菌株M7-6在厭氧發(fā)酵罐中的生長代謝Fig.6 Growth and metabolism of strain M7-6 in the anaerobic fermenter

在第5天，發(fā)酵液的鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到最高值，且原油乳化指數(shù)達(dá)到了60%，說明在擴(kuò)大培養(yǎng)之后，菌株M7-6仍有較好的驅(qū)油潛力。Ghojavand等［29］從伊朗的一油井鹽水樣品中分離出一株菌，在厭氧條件下產(chǎn)脂肽類表活劑，對烴類物質(zhì)的乳化系數(shù)EI24為53%～70%；王靖等［30］從含油土樣中篩選出一株銅綠假單胞菌，其產(chǎn)生的鼠李糖脂類表面活性劑對幾種碳?xì)浠衔锏腅I24為60%～70%。表明菌株M7-6發(fā)酵液也具有良好的乳化活性。

此外，通過對培養(yǎng)過程中的菌群計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，采油相關(guān)有益功能菌（產(chǎn)酸菌和烴降解菌）的數(shù)量有顯著的上升（P＜0.05），由102升至106～107個(gè)/mL。有害功能菌（硫酸鹽還原菌）的數(shù)量略有降低，由103降至102個(gè)/mL。功能菌群計(jì)數(shù)結(jié)果表明，所獲得的最優(yōu)培養(yǎng)基在模擬油藏條件下可以激活有益的油藏本源功能微生物。綜上所述，說明菌株M7-6對油藏原位采油具有重大應(yīng)用潛力。

3　結(jié)論

以鼠李糖脂產(chǎn)生菌M7-6為研究對象，在模擬油藏條件（溫度、pH、礦化度和缺氧）下進(jìn)行了培養(yǎng)基配方的優(yōu)化。最優(yōu)培養(yǎng)基配方（g/L）為甘油70.3、NaNO34.87、Na2HPO4·3H2O 6.9、NaH2PO45.49和MgSO4·7H2O 0.40。菌株M7-6在此培養(yǎng)基中高效生產(chǎn)鼠李糖脂的最適接種量為1%。用此培養(yǎng)基配方對菌株M7-6進(jìn)行了發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)，菌株M7-6可以將培養(yǎng)體系的表面張力降至38.4 mN/m；發(fā)酵罐中的有益功能菌（烴降解菌、產(chǎn)酸菌）豐度有所增加，而有害功能菌（硫酸鹽還原菌）在不斷減少。該研究結(jié)果為菌株M7-6的油田現(xiàn)場應(yīng)用提供了參考數(shù)據(jù)。

［1］ 張金秋.生物表面活性劑對稠油化學(xué)降黏增效作用的研究［J］.精細(xì)石油化工進(jìn)展，2014，16（1）:36-40.

［2］ 趙國文，張麗萍，白利濤.生物表面活性劑及其應(yīng)用［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2010，40（4）:293-295.

［3］ 杜瑾，郝建安，張曉青，等.微生物合成鼠李糖脂生物表面活性劑的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2015，32（4）:5-11.

［4］ 李俊峰，劉麗.脂肽類生物表面活性劑的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2015，32（1）:12-15.

［5］ 吳柏志，李宜強(qiáng).PBS菌的趨化性與提高原油采收率理解［J］.環(huán)境科學(xué)，2005，26（5）:132-136.

［6］ 趙玲莉，高雁，張濤，等.微生物驅(qū)油技術(shù)在克拉瑪依油田的應(yīng)用［J］.石油化工應(yīng)用，2015，34（9）:40-42.

［7］ 王冠，崔延杰，張凱，等.弱凝膠驅(qū)后高含水稠油油藏微生物提高采收率技術(shù)研究及應(yīng)用［J］.長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2015，12（11）:74-79.

［8］ 班允赫，張瀠月，史榮久，等.一株快速產(chǎn)脂肽解淀粉芽孢桿菌的篩選及其產(chǎn)物特性［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2015，34（6）: 1682-1688.

［9］ 張清軍，張敏，王京秀，等.稠油污水原位升級達(dá)標(biāo)現(xiàn)場試驗(yàn)研究［J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（8）:63-69.

［10］ 馮海柱，程武剛，陳剛，等.生物表面活性劑提高采收率技術(shù)室內(nèi)研究［J］.當(dāng)代化工，2015，44（2）:243-244.

［11］ 汪衛(wèi)東，汪竹，耿雪莉，等.美國微生物采油技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用效果分析［J］.油氣地質(zhì)與采收率，2002，9（6）:75-76.

［12］ 樂建君，于盛鴻，崔長海，等.低滲透油田微生物采油現(xiàn)場試驗(yàn)研究［J］.精細(xì)石油化工進(jìn)展，2004，5（2）:13-15.

［13］ 伍曉林，趙玲俠，樂建君，等.大慶油田聚驅(qū)后油藏內(nèi)源微生物激活劑的篩選和效果評價(jià)［J］.南開大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，45（4）:105-110.

［14］ 梁小龍，趙峰，史榮久，等.原生質(zhì)體融合構(gòu)建高效產(chǎn)脂肽工程菌［J］.中國生物工程雜志，2014，34（11）:76-84.

［15］ 趙峰.厭氧產(chǎn)鼠李糖脂S2-氧化工程菌的構(gòu)建及微生物驅(qū)油潛力評價(jià)［D］.北京:中國科學(xué)院大學(xué)，2013.

［16］ ZHAO F，SHI R，ZHAO J，et al.Heterologous production of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid under anaerobic conditions for microbial enhanced oil recovery［J］.J Appl Microbiol，2015，118（2）:379-389.

［17］ ZHAO F，MANDLAA M，HAO J，et al.Optimization of culture medium for anaerobic production of rhamnolipid byrecombinant Pseudomonas stutzeri Rhl for microbial enhanced oil recovery［J］. Lett Appl Microbiol，2014，59（2）:231-237.

［18］ 李萬峰，顏學(xué)軍.大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）的數(shù)學(xué)推導(dǎo)與計(jì)算機(jī)程序的應(yīng)用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（6）: 923-925.

［19］ 劉淑艷，馬惠蕊，蔣丹，等.最可能數(shù)的精確計(jì)算及其在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，201l，28（10）: 516-519.

［20］ YOUSSEF N H，DUNCAN K E，NAGLE D P，et al.Comparison of methodstodetectbiosurfactantproductionbydiverse microorganisms［J］.J Microbiol Methods，2004，56:339-347.

［21］ 孫琳，蒲萬芬，吳雅麗.表面活性劑高溫乳化性能研究［J］.油田化學(xué)，2011，28（3）:275-279.

［22］ ZHAO F，ZHANG J，SHI R，et al.Production of biosurfactant by a Pseudomonas aeruginosa isolate and its applicability to in situ microbial enhanced oil recovery under anoxic conditions［J］.RSC Adv，2015，45（5）:36044-36050.

［23］ 顧生輝，朱莉，詹曉北，等.以甘油為底物鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育［J］.生物加工過程，2015，13（1）:54-59.

［24］ 孫全蓮.銅綠假單胞菌的篩選及產(chǎn)鼠李糖脂發(fā)酵條件的研究［D］.西安:西北大學(xué)，2014.

［25］ 夏文杰，董漢平，俞理.鼠李糖脂發(fā)酵條件優(yōu)化和采油應(yīng)用研究［J］.深圳大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2010，27（4）:482-489.

［26］ 梁生康，王修林，單寶田.假單胞O-2-2利用油脂廢水生產(chǎn)鼠李糖脂研究［J］.現(xiàn)代化工，2005，25（增刊1）:192-196.

［27］ WU J Y，YEH K L，LU W B，et al.Rhamnolipid production with indigenous Pseudomonas aeruginosa EM1 isolated from oilcontaminated site［J］.BioresourTechnol，2008，99（5）: 1157-1164.

［28］ SOBERON-CHAVEZ G，LEPINE F，DEZIEL E.Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，68（6）:718-725.

［29］ GHOJAVAND H，VAHABZADEHF，AZIZMOHSENIF.A halotolerant，thermotolerant，andfacultativebiosurfactant producer:identificationandmolecularcharacterizationofa bacterium and evolution of emulsifier stability of a lipopeptide biosurfactant［J］.Biotechnol Bioproc Eng，2011，16:72-80.

［30］ 王靖，章厚名，安明泉，等.高效產(chǎn)表面活性劑菌株（Lz2-1）的篩選及其特性研究［J］.石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2009，23（3）:33-36.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Optimization of culture medium for rhamnolipid producing bacterial strain M7-6 under simulated oil reservoirs conditions

GUO Chao1，2，ZHAO Feng1，ZHENG Tiantian1，2，SHI Rongjiu1，HAN Siqin1，CUI Qingfeng3，ZHANG Ying1
（1.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering，Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Institute of Porous Flow&Fluid Mechanics，PetroChina Research Institute of Exploration and Development（Langfang），Langfang 065007，China）

Based on a rhamnolipid producing bacterial strain Pseudomonas aeruginosa M7-6，medium（carbon source，nitrogen source，C/N ratio，and mineral factors）was optimized for efficiently producing rhamnolipid under simulated oil reservoir conditions（temperature，pH and absence of oxygen）.Using the optimized medium，effect of different inoculums amount on anaerobic production of rhamnolipid by M7-6 was studied.Strain M7-6 was cultured in a 6-L anaerobic fermentor using oilfield production water to prepare medium，to evaluate the rhamnolipid production by M7-6 under simulated conditions and study the competitive activity of M7-6 with other native microorganisms.M7-6 could efficiently produce rhamnolipid under simulated conditions with glycerol as carbon source and nitrate as nitrogen source.Theoptimum C/N ratio is 14.4∶1，and the least inoculums amount is 1%（V/V）.Strain M7-6 can reduce surface tension of culture system to 38.4 mN/m in the anaerobic fermenter.Moreover，the numbers of oil degrading bacteria and acid producing bacteria were increased，and the number of sulfate reducing bacteria was decreased.

rhamnolipid；simulated oil reservoir conditions；anaerobic activator；microbial enhanced oil recovery

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.013

Q939.97；TE357

A

1672-3678（2016）03-0068-07

2016-01-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2013AA064402）

郭 超（1992—），男，黑龍江伊春人，研究方向:微生物采油；張 穎（聯(lián)系人），研究員，E-mail:yzhang@iae.ac.cn