海洋生物中抗氧化酶的研究進(jìn)展

方春華，喬　琨，劉智禹*，陳麗嬌

[1．福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門(mén))，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013；3．福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361013]

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海洋生物中抗氧化酶的研究進(jìn)展

方春華1，2，喬琨2，3，劉智禹2，3*，陳麗嬌1*

[1．福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(廈門(mén))，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013；3．福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361013]

自由基是帶有不成對(duì)電子的原子、分子、離子或原子團(tuán)，許多外源因素如紫外輻射、環(huán)境毒物、高溫、低氧等脅迫均會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，從而引起細(xì)胞的過(guò)氧化損傷。為了避免自由基引起的細(xì)胞損傷，防止氧化壓力造成機(jī)體的疾病及死亡，海洋動(dòng)物自身形成了一個(gè)有效的抗氧化防御系統(tǒng)，包括由超氧化歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GPx)、硫氧還蛋白(TRx)與硫氧還蛋白過(guò)氧化酶(TPx)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GST)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)以及非抗氧化酶系統(tǒng)。本文主要闡述抗氧化酶的來(lái)源、分布與分類(lèi)，理化性質(zhì)以及海洋生物中抗氧化酶的研究進(jìn)展，為其應(yīng)用前景提供理論依據(jù)。

抗氧化酶；自由基；海洋生物；研究進(jìn)展

氧化還原反應(yīng)是自然界中一個(gè)重要的反應(yīng)機(jī)理，通常會(huì)誘發(fā)自由基即活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，包括超氧陰離子(O2·-)、羥自由基(HO·)、羥過(guò)氧自由基(HO2·)、單線(xiàn)態(tài)氧(·O2)、過(guò)氧化氫(H2O2)、次氯酸(HOCl)等[1]。活性氧在提供能量的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒害作用，對(duì)機(jī)體造成一定的損傷，其可以直接或者間接攻擊機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞組分，破壞其細(xì)胞膜，造成酶活性降低甚至失活以及直接損害細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)[2-3]，進(jìn)而造成機(jī)體病變。

為了減少自由基對(duì)自身的損壞，機(jī)體需要一整套完善的抗氧化系統(tǒng)，以維持自由基在體內(nèi)的平衡[4]。常見(jiàn)的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px或GPx)、硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRx)、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(Thioredoxin peroxidase，TPx)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases，GST)等。各個(gè)抗氧化酶相互影響、相互作用，共同維系機(jī)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而降低自由基對(duì)機(jī)體的損害程度。

目前，抗氧化酶類(lèi)多從動(dòng)植物以及微生物中提取得到，其通常作為添加劑被應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域；而從海洋生物中獲取到的抗氧化酶類(lèi)，雖已在化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)被開(kāi)發(fā)利用，但是在食品等加工行業(yè)中的應(yīng)用還處于初級(jí)階段。海洋生物酶類(lèi)作為一種天然、安全的可開(kāi)發(fā)利用資源，在現(xiàn)代社會(huì)生活中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對(duì)海洋生物抗氧化酶的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步探索海洋生物資源的應(yīng)用提供參考。

1　超氧化物歧化酶(SOD)

1.1超氧化物歧化酶的發(fā)現(xiàn)與來(lái)源

1938年，Mann和Keilin[5]發(fā)現(xiàn)一種淡藍(lán)色的含銅蛋白即銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，Cp)，1969年，McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋白具有催化發(fā)生歧化反應(yīng)的作用，稱(chēng)為超氧化物歧化酶(SOD)[6]。被譽(yù)為“人體清道夫”的SOD是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物體內(nèi)的酸性金屬酶，通常在植物中被發(fā)現(xiàn)得較多。其在體內(nèi)的作用是清除外源性和內(nèi)源性物質(zhì)引起的自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和延緩機(jī)體衰老等，以獲得保護(hù)生物體的效果。銅藍(lán)蛋白與后來(lái)發(fā)現(xiàn)的SOD性質(zhì)有很大的相似性，都能催化H2O2生成水和氧氣，表現(xiàn)出具有清除羥氧自由基等活性氧的抗氧化能力。

1.2超氧化物歧化酶的分類(lèi)與分布

SOD按其不同的金屬輔基主要分為三類(lèi)：(1)鐵超氧化物歧化酶(Ferrum SOD，F(xiàn)e-SOD)；(2)錳超氧化物歧化酶(Manganese SOD，Mn-SOD)；(3)銅鋅超氧化物歧化酶(Copper and zinc SOD，Cu-Zn-SOD)[7-8]，通常，Cu-Zn-SOD又可以分為氨基酸N端信號(hào)序列的胞外Cu-Zn-SOD和無(wú)氨基酸N端信號(hào)序列的胞內(nèi)Cu-Zn-SOD兩種形式[9]。按其結(jié)構(gòu)主要分為兩族：一族是Cu-Zn-SOD，另一族是Fe-SOD和Mn-SOD[10]。對(duì)Cu-Zn-SOD發(fā)現(xiàn)較多，其機(jī)理研究得也比較透徹。另外，也有在鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)的鎳超氧化物歧化酶(Nickel SOD，Ni-SOD)[11]和鐵鋅超氧化物歧化酶(Ferrum and zinc SOD，F(xiàn)e-Zn-SOD)，但目前對(duì)這兩類(lèi)超氧化歧化酶的研究很少。杜邦公司運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)的方法分析Ni-SOD的序列[12]，為進(jìn)一步的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

1.3超氧化物歧化酶的理化性質(zhì)

四種SOD主要的同工酶的理化性質(zhì)如表1[13-16]所示。Cu-Zn-SOD被發(fā)現(xiàn)研究得最早，也被應(yīng)用得最為廣泛，Mn-SOD是在Cu-Zn-SOD的基礎(chǔ)上逐漸被發(fā)現(xiàn)出來(lái)的，而后Fe-SOD、Ni-SOD、Fe-Zn-SOD、錳鐵超氧化物歧化酶(Manganese and ferrum SOD ，Mn-Fe-SOD)也相繼被研究發(fā)現(xiàn)。只是后兩種SOD同工酶的相關(guān)性質(zhì)被研究報(bào)道得少，其中Fe-Zn-SOD在鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[15]中曾被發(fā)現(xiàn)；Mn-Fe-SOD發(fā)現(xiàn)于Pyrobaculumcalidifontis細(xì)胞質(zhì)部分[16]。

表1　超氧化物主要種類(lèi)的分析[13-16]

續(xù)表1

SOD的三維結(jié)構(gòu)存在很大的相似性，不同SOD基因表達(dá)具有組織和發(fā)育的特異性，同一SOD基因在不同的生活周期、不同的組織，其表達(dá)水平也不同。病原菌感染、藥物刺激以及生態(tài)的改變均會(huì)誘導(dǎo)SOD基因表達(dá)[17]。二硫鍵分析表明，SOD含有3個(gè)半胱氨酸(Cystine，Cys)，形成1個(gè)二硫鍵，連接著第17位和第107位的Cys[18]。SOD在機(jī)體系統(tǒng)中還發(fā)揮著免疫功能，具有提高細(xì)胞的吞噬能力和抵御病毒的侵害功能[19]，因而經(jīng)常被用作評(píng)價(jià)環(huán)境因子的脅迫水平與水域污染的潛在指標(biāo)[20-21]。

1.4海洋生物超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展

徐歡歡[22]通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增褶紋冠蚌(Cristariaplicata)胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶(Cp-icCuZnSOD)基因，獲得開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)為468 bp，編碼155個(gè)氨基酸。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)結(jié)果顯示，可溶性蛋白在20℃時(shí)被誘導(dǎo)產(chǎn)生，當(dāng)有Cu2+或Zn2+存在時(shí)更利于Cp-icCuZnDOS基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明補(bǔ)充Cu2+或Zn2+可以提高其酶活性；SOD酶活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白在60℃以下、pH2.0～9.0范圍內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)，其活性高達(dá)80%以上，并且對(duì)8 mol/L尿素和8%SDS有可耐受性；模擬的乙醇損傷細(xì)胞模型試驗(yàn)顯示，rCpSOD蛋白能夠保護(hù)易被乙醇損傷的L02肝細(xì)胞。段立柱等人[23]研究不同殼性狀蝦夷扇貝體腔液中的三種抗氧化酶活力，結(jié)果表明蝦夷扇貝貝殼的殼色性狀與體腔液中的SOD酶活力存在一定的相關(guān)性。姜冰等[24]對(duì)蝦夷扇貝銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行研究，結(jié)果得到其序列全長(zhǎng)為1 046 bp，ORF框?yàn)?62 bp，編碼153個(gè)氨基酸，其氨基酸序列上的銅鋅位點(diǎn)與已知的Cu-Zn-SOD的結(jié)構(gòu)具有很大的相似性；對(duì)蝦夷扇貝組織部位進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在不同組織該基因相對(duì)表達(dá)量的比較為鰓>腎>血淋巴。王卓等[25]研究碳酸鹽堿度對(duì)青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)幼魚(yú)肝和腎SOD酶活性的影響，結(jié)果表明濃度為32 mmol/L(CA32)和64 mmol/L(CA64)的碳酸鹽堿度被脅迫3 d后均可提高SOD酶活性，說(shuō)明青海湖裸鯉能在堿性環(huán)境下表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)能力。趙曼曼等[26]研究哈維弧菌(Vibrioharveyi)、鮑類(lèi)皰疹病毒(Abaloneherpesvirus，AbHV)懸液對(duì)雜色鮑(Haliotisdiversicolor)SOD的影響，結(jié)果顯示哈維弧菌感染第6 h時(shí)SOD有升高的趨勢(shì)，而鮑類(lèi)皰疹病毒感染使SOD活性呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明雜色鮑在受到細(xì)菌或病毒等物質(zhì)的入侵時(shí)都會(huì)引起抗氧化酶的變化，使得抗氧化酶在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出一定的抑菌效果，從而保護(hù)機(jī)體不受外源物質(zhì)的破壞。

2　過(guò)氧化氫酶(CAT)

2.1過(guò)氧化氫酶的發(fā)現(xiàn)與來(lái)源

過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)又稱(chēng)觸酶，廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物和微生物中，由Loew在1901年發(fā)現(xiàn)并命名，后在1936年由Stern證明其活性中心是卟啉環(huán)[27]。其實(shí)在18世紀(jì)初期就有Schonbein認(rèn)為肯定存在著某種酶的作用使動(dòng)植物組織分解產(chǎn)生氧氣來(lái)提供能量的需要，只是由于當(dāng)時(shí)的相關(guān)技術(shù)水平受到限制而未能確定是CAT。

2.2過(guò)氧化氫酶的分類(lèi)與分布

CAT廣泛存在自然界需氧型生物中，其按符合進(jìn)化關(guān)系的理化性質(zhì)可分為以下三類(lèi)：一是典型性CAT(Typical CAT)；二是非典型性CAT(Atypical CAT)；三是CAT-過(guò)氧化物酶(Catalase-peroxidases，Kat G)。其中，CAT的相關(guān)性質(zhì)如表2[28-34]。按金屬輔基分為二類(lèi)：鐵CAT(Ferrum CAT，F(xiàn)e-CAT)和錳CAT(Manganese CAT，Mn-CAT)。不過(guò)，從目前的研究發(fā)展來(lái)看，很多CAT都?xì)w類(lèi)為符合進(jìn)化方向基礎(chǔ)的某一類(lèi)型。目前已發(fā)現(xiàn)的90多種CAT都屬于典型性CAT、非典型CAT或CAT-過(guò)氧化物酶三種中的任何一種。

表2　CAT的分類(lèi)及其相關(guān)性質(zhì)[28-34]

2.3過(guò)氧化氫酶的結(jié)構(gòu)分析

CAT作為一種保護(hù)酶，其功能主要是在生物體中清除過(guò)氧化氫，有效防止自由基的產(chǎn)生，保護(hù)機(jī)體組織免受自由基的毒害作用，同時(shí)也可以氧化一些毒性物質(zhì)，最終產(chǎn)物為水，在體內(nèi)起到保護(hù)的防御作用[35]。其最大的特點(diǎn)是具有雙重催化性質(zhì)，既可以作用于過(guò)氧化氫生成水和氧氣，也可以利用過(guò)氧化氫特有的氧化性質(zhì)，氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)等一些化合物。

從牛肝臟中發(fā)現(xiàn)的CAT單體是由一條含有506個(gè)氨基酸的肽鏈組成的，每個(gè)CAT單體結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜，由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是前75個(gè)氨基酸，由α-螺旋折疊的作用會(huì)形成類(lèi)似“手臂”形的球狀亞基；第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是包括244個(gè)氨基酸，存在的β-折疊會(huì)改變空間組織結(jié)構(gòu)形成β桶狀結(jié)構(gòu)；第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是包括115個(gè)氨基酸的“包裹”區(qū)域，其含有的螺旋結(jié)構(gòu)包含了血紅素酚配體和Tyr357；第四個(gè)結(jié)構(gòu)域是包括69個(gè)氨基酸的四級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)域。這四個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用、相互影響，共同發(fā)揮CAT的雙功能性質(zhì)，清除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)機(jī)體不被損害[36]。通常CAT中的四級(jí)結(jié)構(gòu)是四聚體，錯(cuò)綜復(fù)雜的四聚體結(jié)構(gòu)相互纏繞，其中包含的血紅素輔基常暴露在一個(gè)長(zhǎng)30、寬15的漏斗莊通道外。血紅素輔基多是由疏水性氨基酸組成，如Arg、Ala、Tyr等[37]。CAT在磷酸戊糖循環(huán)中充當(dāng)?shù)慕巧秦?fù)責(zé)結(jié)合運(yùn)輸NADPH[38]。由于CAT的種類(lèi)不同，與NADPH結(jié)合的能力也經(jīng)常有所不同。

2.4海洋生物過(guò)氧化氫酶的研究進(jìn)展

傅明駿等[39]利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)獲得斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)CAT基因(PmCAT)cDNA全長(zhǎng)為1 909 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 563 bp，編碼520個(gè)氨基酸。該基因在對(duì)蝦不同的組織部位中表達(dá)量不同，其中鰓最高，肝胰腺和腦神經(jīng)次之。陳琳琳[40]研究汞、硒兩種重金屬對(duì)紫貽貝(Mytilusedulis)CAT酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)汞對(duì)CAT酶活力的影響從第4天開(kāi)始顯著下降，硒對(duì)CAT酶活力的影響與對(duì)照組相比有穩(wěn)定體內(nèi)環(huán)境的趨勢(shì)，這一結(jié)果說(shuō)明汞抑制了CAT酶活力的產(chǎn)生，適量的硒能增強(qiáng)抗氧化作用。梁健等[41]利用急性毒性實(shí)驗(yàn)研究Cu2+對(duì)青蛤(Cyclinasinensis)的蓄積作用及CAT酶活力的影響，觀(guān)察Cu2+在青蛤不同組織的蓄積情況，研究結(jié)果表明Cu2+對(duì)青蛤的半致死濃度為0.807 mg/L，其導(dǎo)致CAT酶活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，這一研究為進(jìn)一步探索青蛤的免疫應(yīng)激機(jī)理提供數(shù)據(jù)參考。錢(qián)佳慧[42]等利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)和響應(yīng)曲面分析法(RSM)，在溫度范圍19～31℃和鹽度范圍22～38的條件下研究華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)CAT的變化，結(jié)果顯示溫度為26.4℃和鹽度為27.7時(shí)，CAT活性達(dá)到最大，具有增強(qiáng)抵御疾病的功能和提高體內(nèi)抗氧化性能。

3　谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)

3.1谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)與來(lái)源

1961年，Booth J[43]首次從肝臟中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)，后有Combes B逐步完善GST的一些催化活性。1976年，Lawrence在其他生物的組織中也發(fā)現(xiàn)該酶。近年來(lái)，研究學(xué)者不斷在各種哺乳類(lèi)動(dòng)物、軟體動(dòng)物等生物中都發(fā)現(xiàn)了GST。

3.2谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的分類(lèi)與分布

按蛋白的功能可以分為三類(lèi)：(1)可溶的細(xì)胞內(nèi)GST(Cytosolic GST，cGST)；(2)被稱(chēng)作類(lèi)脂酸和谷胱甘肽膜關(guān)聯(lián)蛋白(Membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism，MAPEG)的微粒體GST；(3)質(zhì)粒編碼的細(xì)菌抗磷霉素GST[44]。至今為止，已發(fā)現(xiàn)14種GST，分別為：alpha(α)、beta(β)、delta(δ)、epsilon(ε)、zeta(ζ)、theta(θ)、mu(μ)、nu(ν)、kappa(κ)、pi(π)、sigma(σ)、tau(τ)、phi(φ)和omega(ω)[45]。

3.3谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的理化性質(zhì)

GST又被稱(chēng)為不含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，是分子量在25～27 kDa之間的一種多功能同工酶的二聚體蛋白。其主要功能是結(jié)合體內(nèi)有毒的物質(zhì)，并輸送到體外，從而發(fā)揮解毒的功能。其最大的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合蛋白能力強(qiáng)，具有過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，起到清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用。GST的亞基中均含有N末端區(qū)結(jié)構(gòu)和C末端區(qū)結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)末端結(jié)構(gòu)都有一個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)成了催化活性中心，主要催化結(jié)合親電子物質(zhì)，起到排毒解毒的效果[46]。

3.4海洋生物谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展

張林寶等[47]研究了鎘(Cd)、銅(Cu)兩種重金屬對(duì)菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)肝胰腺和鰓組織內(nèi)GST酶活力的影響，結(jié)果顯示隨著重金屬濃度的增加，菲律賓蛤仔中的GST受到嚴(yán)重的抑制，引起重金屬在體內(nèi)嚴(yán)重蓄積，導(dǎo)致菲律賓蛤仔機(jī)體組織受損或致病。蔣閏蘭等[48]研究金屬菲脅迫對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的急性毒性效應(yīng)，主要采用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)法，設(shè)置了5個(gè)菲濃度梯度1.00、1.63、2.65、4.31和7.00 mg/L對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺和鰓中GST活力的變化，結(jié)果表明低濃度菲處理中華絨螯蟹時(shí)，其肝胰腺和鰓GST活力受誘導(dǎo)顯著；高濃度處理時(shí)則被顯著抑制，引起氧化損傷導(dǎo)致機(jī)體受損。黃周英等[49]在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了三丁基錫(TBT)的高、中、低三種濃度對(duì)文蛤(Meretrixmeretrix)鰓GST酶活力的影響，從分析結(jié)果中得到高濃度的TBT對(duì)文蛤鰓GST酶活力的抑制效果明顯，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GST酶活力會(huì)恢復(fù)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?，這一結(jié)果說(shuō)明了文蛤會(huì)受到TBT的氧化脅迫作用，致使抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，降低其自身的解毒能力。

4　谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)

4.1谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

1957年，Mill[50]首次發(fā)現(xiàn)GPx可以利用其氧化作用來(lái)保護(hù)紅細(xì)胞不被其它物質(zhì)進(jìn)行溶解，并正式命名為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。GPx是從牛紅細(xì)胞中提取出來(lái)的，經(jīng)過(guò)細(xì)致的研究發(fā)現(xiàn)該酶的結(jié)構(gòu)內(nèi)包含硒元素。

4.2谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的分類(lèi)和分布

GPx最早被命名為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，其形式可以分為八種：分別為GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、GPx5、GPx6、GPx7、GPx8，其相關(guān)性質(zhì)如表3[51-54]所示，其包含五種含硒半胱氨酸蛋白和三種不含硒半胱氨酸蛋白，GPx1、GPx2、GPx3均為四聚體結(jié)構(gòu)。

表3　谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的種類(lèi)[51-54]

4.3谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的理化性質(zhì)

GPx在細(xì)胞中利用其自身的氧化還原性質(zhì)起到動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的作用，同時(shí)其還能減少細(xì)胞內(nèi)血小板的聚集效應(yīng)，有效防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，保護(hù)血管壁不被污染物堵塞[55-58]。GPx與硒蛋白有很大的相關(guān)性，有研究已證實(shí)硒蛋白的缺乏會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默病(Alzheimers disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、癲癇、神經(jīng)分裂癥等[59-61]。

GPx是廣泛存在于體內(nèi)的一種低分子量的清除酶制劑，其在與過(guò)氧化氫酶的共同作用下與超氧化物歧化酶有協(xié)同作用，能清除許多自由基，甚至能保護(hù)血紅蛋白和一些含有巰基酶類(lèi)等物質(zhì)，作為機(jī)體組織中重要的巰基化合物，在CAT分解過(guò)氧化氫的過(guò)程中起到不可替代的作用[62]。通常谷胱甘肽(GSH)作為GPx的底物在體內(nèi)進(jìn)行催化，其機(jī)理如下[63]：

ROOH+2GSH→ROH+H2O+ GSSG

(1)

H2O2+2GSH→2H2O+ GSSH

(2)

在體內(nèi)主要清除脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)的作用，與SOD、CAT等抗氧化酶構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)保護(hù)機(jī)體中的DNA、細(xì)胞膜等不被損害。

4.4海洋生物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的研究進(jìn)展

穆希巖等[64]研究了苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚(yú)(Daniorerio)腦和肝臟中GST活性的影響，結(jié)果表明利用50 μg/L苯醚甲環(huán)唑處理斑馬魚(yú)肝臟和腦時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，腦中GPx活性受到顯著抑制的強(qiáng)度比肝臟中的強(qiáng)。王祖峰等[65]利用網(wǎng)箱飼養(yǎng)法研究在飼料中添加蛋氨酸硒對(duì)仿刺參(Apostichopusjaponicus)抗氧化酶的影響，結(jié)果表明添加1.0 mg/kg的硒量時(shí)，與其它抗氧化酶相比，GPx的活性達(dá)到最大為291.32 U/mg，能抵御外源物質(zhì)的入侵和提高仿刺參的免疫力。彭玲等[66]利用方差的方法分析了Cd2+影響厚殼貽貝GPx的含量，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，厚殼貽貝GPx的酶活力先升高后抑制，原因是GSH-Px的硒活性中心受到重金屬Cd2+的攻擊，遭到空間結(jié)構(gòu)的破壞致使酶活性下降甚至失活。

5　硫氧還蛋白(TRx)與硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)

5.1硫氧還蛋白與硫氧還蛋白過(guò)氧化酶的發(fā)現(xiàn)與來(lái)源

硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRx)最早被發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中，主要的功能是作為大腸桿菌內(nèi)核糖核酸還原酶羥基的受體，在機(jī)體內(nèi)起到還原調(diào)節(jié)的作用[67]。植物葉綠體中也有TRx，在光合作用中發(fā)揮活化調(diào)節(jié)蛋白的作用。在細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體上發(fā)現(xiàn)的TRx的結(jié)構(gòu)和功能都表現(xiàn)出極大的不同[68]。

硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(Thioredoxin peroxidase，TPx)是過(guò)氧化物還原酶(Peroxidase)家族的一員，是過(guò)氧化物酶超家族的新成員，廣泛存在于自然界中，在機(jī)體內(nèi)能夠清除多種自由基，維持體內(nèi)環(huán)境平衡[69-70]。

5.2硫氧還蛋白與硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的種類(lèi)與分布

TRx和TPx都廣泛存在于真核生物和原核生物中。目前TRx已經(jīng)被分離出有三種同工酶，分別是：(1)存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核的TRx1；(2)存在于線(xiàn)粒體中的TRx2；(3)存在于睪丸中的TRx3[71]。其中TRx1被發(fā)現(xiàn)得最早，而且在植物中廣泛分布。雖然被發(fā)現(xiàn)的硫氧還蛋白還原酶(TRx-R)在真核和原生生物的不同部位，但其最主要的作用是起到還原調(diào)節(jié)。另外，其還有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)再灌注損傷等功能。

TPx中TPx1、TPx2、TPx6均位于胞漿中；TPx3存在于線(xiàn)粒體；TPx4位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)；TPx5則分布在過(guò)氧化物酶體內(nèi)[72-73]。

5.3硫氧還蛋白與硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

TPx是一種半胱氨酸過(guò)氧化物酶，一種分子量為12 kDa的酸性蛋白。TPx的特點(diǎn)是可溶性強(qiáng)、分子量低、熱穩(wěn)定，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。其與硫氧還蛋白還原酶(TRx-R)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)構(gòu)成TRx系統(tǒng)，該系統(tǒng)在細(xì)胞中的功能是信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)蛋白的還原[74]，該系統(tǒng)存在的最大優(yōu)勢(shì)是減少機(jī)體的氧化應(yīng)激引起的損傷，從而有效保護(hù)生物大分子的完整性[75]。TPx若按氨基酸堿基序列劃分為：o、m、f、h、x、y六類(lèi)，而且分布的位置也不盡相同，但是發(fā)揮的作用與功能具有相似性。由于其本身具有的高度保守位點(diǎn)CGPC(Cys-Gly-Pro-Cys)，使得其發(fā)揮最大的還原能力，使巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，參與細(xì)胞內(nèi)的許多生化反應(yīng)。目前，TPx的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，如在細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中抑制細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答以及增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子活性等[76]。另外，硒元素的存在會(huì)對(duì)TRx有影響，主要對(duì)TPx有調(diào)控氧化還原的作用。

TPx含有一個(gè)或者二個(gè)半胱氨酸殘基，其主要分為六種類(lèi)型：前五種同工酶均含有二個(gè)半胱氨酸殘基，第六種同工酶則只含有一個(gè)半胱氨酸殘基。具有相同數(shù)量的半胱氨酸殘基，它們的同源性較高[69]。在體內(nèi)參與細(xì)胞的許多生理生化反應(yīng)，如作為細(xì)胞傳遞的信號(hào)、對(duì)細(xì)胞增殖和分化起調(diào)控作用等。

5.4海洋生物硫氧還蛋白和硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的研究進(jìn)展

TRx在動(dòng)植物以及微生物中都有發(fā)現(xiàn)。在水生動(dòng)物中，呂達(dá)等[77]利用構(gòu)建的cDNA文庫(kù)及高通量測(cè)序方法，獲得TRx基因全長(zhǎng)為804 bp，編碼165個(gè)氨基酸，包含5個(gè)氨基酸構(gòu)成的活性中心；同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法發(fā)現(xiàn)TRx基因在Cd2+脅迫下mRNA在6 h時(shí)處于升高的狀態(tài)，這一結(jié)果表明Cd2+能夠誘導(dǎo)青蛤TRx基因表達(dá)的時(shí)序性升高。在藻類(lèi)中，張彥鋒等[78]從海洋球石藻病毒(Emilianiahuxleyivirus-Eh V 99B1)進(jìn)行克隆TRx基因，利用系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析、生物信息學(xué)方法和工具分析等手段總結(jié)得到該病毒與其他物種有較高的同源性，表明該病毒基因的ORF框?yàn)?91 bp，編碼196個(gè)氨基酸，而且其含有的保守序列與TRx基因的相似度很高，從而在體內(nèi)發(fā)揮二硫鍵的還原作用。由于TRx最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)，也有研究者在其他微生物中發(fā)現(xiàn)該基因。王曉慧等[79]利用生物技術(shù)方法克隆出了黑曲霉TRx系統(tǒng)中的TRx基因，其全長(zhǎng)為324 bp，分子量為11.912 kDa，并證實(shí)其催化位點(diǎn)是Cys33和Cys37。孫盛明等[80]利用cDNA末端快速克隆方法獲得青蝦(Macrobrachiumnipponense)的TPx全長(zhǎng)cDNA序列為878 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為594 bp，可以編碼198個(gè)氨基酸；研究還發(fā)現(xiàn)蝦過(guò)氧化物還原酶基因與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)過(guò)氧化物還原酶具有親緣關(guān)系，該基因在青蝦不同組織中的相對(duì)表達(dá)量按高到低依次為肝胰腺(Hepatopancreas)>鰓(Gill)>肌肉(Muscle)>卵巢(Ovary)>心臟(Heart)>腸道(Intestine)。曹勁松等[81]采用親和層析、SDS-PAGE、免疫印跡法(Western-blotting)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白與人紅細(xì)胞膜蛋白、TPx具有較高的同源性，推測(cè)TPx可能是二者的結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究血藍(lán)蛋白的相關(guān)性質(zhì)提供理論依據(jù)。賀琳等[82]利用重組技術(shù)研究檉柳(Tamarixhispida)TPx家族基因(ThPrx1)的抗逆功能，結(jié)果表明該基因具有抗鹽、耐堿、抗重金屬等抗脅迫能力，從而為優(yōu)化抗逆條件提供證據(jù)與參考。孫晶等[83]研究斑馬魚(yú)過(guò)氧化物還原酶的相關(guān)功能和結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，過(guò)氧化物還原酶發(fā)揮的抗氧化性很可能是與半胱氨酸殘基有關(guān)。

6　抗氧化酶的應(yīng)用及展望

目前，利用生物技術(shù)獲取抗氧化酶已成為一種有效的途徑，其被高效獲得的同時(shí)還可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。抗氧化酶具有一定的清除體內(nèi)自由基的能力，有益于人體健康，其常作為添加劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑以及保鮮劑等用途被廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用到化妝品、食品、醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域。我國(guó)首次通過(guò)基因克隆等生物技術(shù)從念珠藻中得到Fe-SOD基因，這為以后的基因克隆技術(shù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

近年來(lái)，從海洋生物中獲得的抗氧化酶作為添加輔助原料在化妝品、醫(yī)藥行業(yè)領(lǐng)域中的運(yùn)用格局趨于穩(wěn)定成熟。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家以及日本就有添加SOD而制成的面膜、面霜等高級(jí)化妝品；國(guó)內(nèi)也有SOD霜等制品，這一類(lèi)產(chǎn)品主要是通過(guò)改善內(nèi)部肌膚而達(dá)到清潔皮膚的作用。另外，有報(bào)道稱(chēng)在軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物等海洋生物中都發(fā)現(xiàn)有SOD，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，世界各國(guó)采用基因工程技術(shù)獲得的SOD已經(jīng)被研制成藥用酶的產(chǎn)品而在臨床治療中得到使用，并在對(duì)抗疾病的過(guò)程中取得了一定的治愈效果。其他抗氧化酶同樣也被逐步發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用到各行業(yè)領(lǐng)域。但是，在開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品的過(guò)程中仍然存在一些技術(shù)上以及理論上的難題，如考慮如何提高抗氧化酶的抗氧化性、如何延長(zhǎng)產(chǎn)品的貯藏期等。在技術(shù)上需要突破的問(wèn)題還有很多，需要不斷對(duì)抗氧化酶進(jìn)行深入探究。抗氧化酶在現(xiàn)代社會(huì)中扮演著越來(lái)越重要的角色，為改善人類(lèi)生活健康而存在著巨大的發(fā)展空間與利用價(jià)值。

如今，海洋生物中的抗氧化酶多已被發(fā)現(xiàn)，但是開(kāi)發(fā)應(yīng)用到食品行業(yè)還處于初級(jí)階段，相信在未來(lái)不斷的探索中能夠?qū)崿F(xiàn)資源有效利用最大化，使添加了抗氧化酶的產(chǎn)品能夠改善風(fēng)味，延長(zhǎng)保質(zhì)期，保證質(zhì)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。

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The research progress of antioxidant enzymes in marine organisms

FANG Chunhua1，2，QIAO Kun2，3，LIU Zhiyu2，3*，CHEN Lijiao1*

[1.School of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen)，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China；3.Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361013，China]

Free radicals refer to an atom，molecule，or ion that has unpaired valence electrons.Many environmental stimuli，including ultraviolet light，environmental toxins，and hyperthermia，generate high level of free radicals，which leads to cellular oxidative damage.In order to avoid cellular oxidative damage and prevent disease and death caused by oxidative stress，marine organisms develop an effective defense system.The antioxidant system of mollusks includes enzymatic antioxidants such as superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)，glutathione peroxidase(GPx)，thioredoxin peroxidase(TPx)，peroxide enzyme(POD)，glutathione-S-transferase(GST)and non-enzymatic antioxidants.This article focuses on the research progress of antioxidant enzymes on the sources，distribution and classification as well as the properties，which provides the theoretical basis for its application and prospect.

antioxidant enzymes；radical；marine organism；research progress

2016-06-17

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201405016)；福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014NZ0001-1)；廈門(mén)市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12CZP001SF02)；福建省省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)(2015R1003-9)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目.

依托平臺(tái)：海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)；福建省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(2014FJPT01)；廈門(mén)南方海洋研究中心項(xiàng)目(14PZY017NF17).

方春華(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全.E-mail：2461307219@qq.com

劉智禹(1972-)，男，教授級(jí)高工，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用.E-mail：negroliu@163.com；陳麗嬌(1962-)，女，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工.E-mail：chenlijiao@126.com

Q51

A

1006-5601(2016)04-0331-12

方春華，喬琨，劉智禹，等.海洋生物中抗氧化酶的研究進(jìn)展[J].漁業(yè)研究，2016，38(4)：331-342.