滿山紅中黃酮類成分液相色譜指紋圖譜研究

李紅梅，佟志軍，孫　麗，王安波，張　雷

(1.通化東寶藥業(yè)股份有限公司,吉林 通化 134123;2.吉林天力泰藥業(yè)有限公司，吉林 長白 134400;3.長春中醫(yī)藥大學 長春130117)

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滿山紅中黃酮類成分液相色譜指紋圖譜研究

李紅梅1，佟志軍2*，孫麗2，王安波2，張雷3

(1.通化東寶藥業(yè)股份有限公司,吉林 通化 134123;2.吉林天力泰藥業(yè)有限公司，吉林 長白 134400;3.長春中醫(yī)藥大學 長春130117)

目的利用反相高效液相色譜法建立滿山紅中黃酮類成分的指紋圖譜，為科學評價及有效控制滿山紅藥材質(zhì)量提供新的方法。方法分析10個不同產(chǎn)地滿山紅樣品的色譜圖，采用國家食品藥品監(jiān)督管理局推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”計算處理，建立由18個共有峰及其他指紋峰組成對照指紋圖譜，確定2個主要指紋峰。結(jié)果通過夾角余弦法和相關系數(shù)法計算滿山紅10個樣品與對照指紋圖譜的相似度，得到滿意結(jié)果。結(jié)論所建立的對照指紋圖譜可以用來區(qū)別不同產(chǎn)地滿山紅藥材的優(yōu)劣，為進一步控制滿山紅質(zhì)量提供依據(jù)。

高效液相色譜；滿山紅；指紋圖譜；質(zhì)量控制

滿山紅為杜鵑花科植物興安杜鵑RhododendrondamricumL.的干燥葉。主要分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古。滿山紅主要有效成分為揮發(fā)油和黃酮類成分，后者主要有金絲桃苷、杜鵑素、山奈酚、槲皮素楊梅酮、黃梅素等。具有止咳、祛痰作用[1]。目前《中國藥典·1部》滿山紅項下只有鑒別和測定杜鵑素含量(大于0.08%)[2]，這種單一成分的檢測并不足以表明藥材質(zhì)量。中藥指紋圖譜是控制中藥材質(zhì)量的有效方式之一，已日益成為國內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評價模式[3]。

1　儀器與試藥

1．1儀器高效液相色譜儀A111iane2695(Waters公司)；AG245型電子天平(瑞士梅特勒公司)；SK3200型超聲波清洗儀(上?？茖С曈邢薰?。

1．2藥品與試劑金絲桃苷，批號:141211，供含量測定用，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；杜鵑素，批號:1108-2006041，供含量測定用，購于中國食品藥品檢定研究院。滿山紅葉于2014年9月末—10月初采于黑龍江省和吉林省不同10個地區(qū)。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學鑒定教研室鑒定為興安杜鵑葉。甲醇、石油醚(30～60 ℃)、乙酸乙酯、乙醇均為分析純。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；乙酸為色譜純(美國Fedia公司)；水為哇哈哈純凈水。

2　方法與結(jié)果

2．1色譜分析Weters Cortees C18柱(100 mm×4．6 mm，2．7 μm)，以甲醇為流動相A，以0．3%醋酸溶液為流動相B，梯度洗脫:0～15 min，15%A～25%A，30～50 min，25%A～45%A,60～70 min，45%A～85%A,85～90 min，85%A～100%A，流速:0．6 mL/min；柱溫:30 ℃；檢測波長:300 nm。理論板數(shù)按杜鵑素峰計應不低于5 000。

2．2參照物溶液的制備取杜鵑素對照品和金絲桃苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含杜鵑素0．52 mg、金絲桃苷0．59 mg的溶液，即得。

2．3供試品溶液的制備取滿山紅細粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加60%甲醇70 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，濾過，用60%甲醇洗滌濾渣，洗液并入濾液中，濾液蒸干，殘渣加水30 mL，轉(zhuǎn)移置分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)30 mL提取，棄去石油醚，用乙酸乙酯提取3次(30、25、25 mL)，合并提取液，殘渣用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。2．4測定精密吸取對照溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄90 min色譜圖，即得。

2．5方法學考察2．5．1精密度試驗取同一批樣品，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在1%和5%以內(nèi)，說明精密度良好。

2．5．2重復性試驗取同一批樣品，平行制備6份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果表明各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在2%和5%以內(nèi)，說明重復性很好。

2．5．3穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，分別在0、2、8、16、24 h進樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在1%和5%以內(nèi)，說明供試品溶液中成分在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2．6滿山紅中黃酮類成分指紋圖譜的建立在優(yōu)化的色譜條件，對10個不同產(chǎn)地滿山紅藥材供試品溶液進行HPLC測定，記錄HPLC色譜圖。將10批樣品的指紋圖譜導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2004A版),生成指紋圖譜共有模式。在90 min內(nèi)出現(xiàn)18個共有峰，通過與對照品的HPLC色譜比較，確定8號峰為金絲桃苷、16號峰為杜娟素峰，以杜娟素峰為參照峰，即S峰，依次標記為1～18。

滿山紅中黃酮類成分共有模式指紋圖譜，見圖1。

圖1　滿山紅黃酮類成分共有模式指紋圖譜

對照品的HPLC色譜圖，見圖2。

圖2　前峰為“金絲桃苷”，后峰為“杜鵑素”

特征指紋峰的共有模式的10批供試品的疊加圖，見圖3。

圖3　10批供試品的疊加圖

2．7不同產(chǎn)地的滿山紅藥材中黃酮類成分相似度比較以共有模式作為對照指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2004A版)對10批不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜進行相似度評價，利用夾角余弦法和相關系數(shù)法計算每個樣品與基本樣本,得到每個樣品的色譜與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果10批滿山紅藥材大部分指紋圖譜的相似度良好，均在0．90以上，符合要求。這表明存在這種共有模式基礎上的個體差異是常見現(xiàn)象，因為藥材生長過程中受多因素影響，因此需要對藥材進行規(guī)范化種植，保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性。

3　小結(jié)

首先考察回流法和超聲法，結(jié)果二者指紋圖譜相似，但回流法供試品中葉綠素多，故采用超聲法。其次考察提取溶劑:甲醇和乙醇，結(jié)果甲醇提取供試品溶液色譜峰多，葉綠素少，又進一步考察甲醇濃度及甲醇用量，最終確定60%甲醇，超聲處理40 min，用量為70 mL為宜。本試驗選用3個公司反相C18柱，最終選擇Weters Cortees C18柱(100 mm×4．6 mm，2．7 μm)色譜柱分離度較好，峰譜信息豐富，保留時間適中。實驗中分別對乙腈-0．3%醋酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0．3%醋酸水溶液等流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫，結(jié)果表明，后者分離效果好。實驗中對20、30、35 ℃ 3種柱溫進行選擇，結(jié)果選擇柱溫30 ℃為宜。流速考察了0．5、0．6、0．8 mL/min 3種流速，結(jié)果顯示流速為0．6 mL/min時，各色譜峰分離度較好。

對不同產(chǎn)地滿山紅藥材中黃酮類成分的指紋圖譜分析可以看出:共有峰的相對保留時間非常接近，RSD很小(1%)，但相對峰面積相差較大，RSD為5%，即不同產(chǎn)地滿山紅藥材中總黃酮的含量差異較大，為保證藥材質(zhì)量，應建立藥材栽培基地。

[1]吉林省中醫(yī)中藥研究所.長白山植物藥志[M].長春:吉林人民出版社,1985:870.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:1部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:339.

[3]謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:124.

Rhododendron dauricum L.flavonoids ingredients in HPLC fingerprint

LI Hongmei1，TONG Zhijun2*，SUN li2，WANG Anbo2，ZHANG Lei3

(1.The Tonghua Dongbao Pharmaceutical co.,LTD.,Tonghua 134123,Jilin Province,China;2.Tianlitai Pharmaceutical co.,LTD.,Changbai 134400,Jilin Province,China;3.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveThe chromatographic fingerprint was established for evaluating and controlling the quality of Rhododendron dauricum L.by reversed-phase high performance liquid chromatog-raphy (RP-HPLC).MethodsTen different original samples were analyzed,and the chromatographic fingerprint of Rhododendron dauricum L.was constructed with 18 fingerprint peaks,among which peaks were common fingerprint peaks and 2 main compounds were identified using the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (Version 2004A) recommended by State Food & Drug Administration.ResultsMethods of vectorcosine and correlation coefficient were used to calculate the similarity of ten samples,and sat-is factory results were obtained.ConclusionThe chromatographic fingerprint can be used to differentiate the raw materials from different sources and be served as a powerful tool for the further quality control of Rhododendron dauricum L.

Liquid chromatography (LC);Rhododendron dauricum L;fingerprint;quality control

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.017

吉林省科學技術廳項目(20130727101YY)。

李紅梅(1970-)，女，大學本科，副高級檢驗師，主要從事中藥化學成分及質(zhì)量標準研究。

佟志軍，電話-15844955777，電子信箱-jlcbsyy@126.com

R284.3

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2095-6258(2016)04-0708-03

2015-12-28)