高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究

楊獻(xiàn)玲，徐多多，高　陽*，李紅月，王海洋

(1．吉林省藥品檢驗(yàn)所，長春130033;2．長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

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高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究

楊獻(xiàn)玲1，徐多多2，高陽2*，李紅月2，王海洋2

(1．吉林省藥品檢驗(yàn)所，長春130033;2．長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

目的探討高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜。方法利用高效液相色譜法對PMP 柱前衍生化的黃芪多糖進(jìn)行糖組成分析。結(jié)果黃芪多糖特定圖譜由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖4種單糖4個(gè)共有峰組成。結(jié)論高效液相色譜法建立的黃芪多糖特征圖譜，其操作方法簡便，具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，可有效控制黃芪多糖的內(nèi)在質(zhì)量。

黃芪多糖;鼠李糖;單糖;圖譜;高效液相色譜法

黃芪多糖是黃芪發(fā)揮作用的主要成分，由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖。黃芪多糖可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時(shí)具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、保肝等作用[1-6]。在多糖的化學(xué)研究中單糖組成分析是一項(xiàng)重要內(nèi)容，隨著現(xiàn)代科學(xué)儀器及研究手段的發(fā)展,通過 PMP柱前衍生化高效液相色譜法[7-9]進(jìn)行組成糖分析，為黃芪多糖特定圖譜的建立提供了簡便、高效的方法，該方法具有分離度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)勢。該特征圖譜的建立對控制黃芪多糖的質(zhì)量具有十分重要的意義。

1　材料

1．1藥品黃芪多糖由吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)延吉股份有限公司提供，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖均購自Sigma公司，純度均 99%以上。

1．2試劑與儀器1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和三氟乙酸(TFA)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。Aglient 1200高效液相色譜儀(美國，包括自動(dòng)進(jìn)樣器，二元泵，紫外檢測器);梅特勒-托利多儀器有限公司AB204-N分析天平。

2　方法與結(jié)果

2．1色譜分離和檢測條件采用Agilent ZORBAX XDB C18(5μ，250 mm×4．6 mm)色譜柱,磷酸鹽緩沖液(pH 6．8 )-乙腈(85∶15)為流動(dòng)相A，磷酸鹽緩沖液( pH 6．8)-乙腈( 60∶40)為流動(dòng)相B，梯度洗脫( 0～10 min，流動(dòng)相A由100% →92%;10～30 min，流動(dòng)相A由92% →70%；30～40 min，流 動(dòng) 相 A 為70%；40～50 min，流動(dòng)相A由70% →100% )，流速0． 9 mL/min，檢測波長250 nm，進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，樣品中4組分均能達(dá)到良好的基線分離，理論板數(shù)按葡萄糖衍生物峰計(jì)算應(yīng)不低于30 000。

2．2參照物溶液的制備取無水葡萄糖對照品5 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加水2 mL使溶解，搖勻，加1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(PMP)1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，密封，于70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為參照物溶液[10-12]。2．3供試品溶液制備取黃芪多糖約10 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃烘箱中水解8 h，吹干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，吹干，重復(fù)3次，加水2 mL使溶解，即得黃芪多糖水解液。將水解液加上述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，置70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為供試品溶液[10-12]。

2．4方法學(xué)考察2．4．1精密度試驗(yàn)取同一批供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時(shí)間 RSD 0．041%～0．063%。表明儀器的精密度良好。

2．4．2穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，考察各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD為0．046%～0．054%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4．3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，精密稱定，按照2．3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，考察各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD為0．685%～0．827%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2．5樣品測定按照2．3項(xiàng)下方法制備10批樣品的供試品溶液，按照2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，得到10批樣品特征圖譜，通過比較不同樣品色譜峰，確定 4個(gè)共有峰，相對保留時(shí)間見表1。

表1　10批黃芪多糖特定圖譜共有峰的相對保留時(shí)間

2．6圖譜分析、數(shù)據(jù)處理和相似度評價(jià)

2．6．1圖譜分析、數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)中將現(xiàn)有已知對照品甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖按照2． 2項(xiàng)下方法制備對照品溶液，分別進(jìn)樣，通過保留時(shí)間確定供試品溶液1號峰為鼠李糖，2號峰為葡萄糖，3號峰為半乳糖，4號峰為阿拉伯糖。通過比對確定在15～20 min之間的色譜峰為PMP溶劑峰。通過10批樣品圖譜分析，上述4個(gè)色譜峰為各批樣品所共有，因此確定為共有特征峰。在共有特征峰中，葡萄糖所占比例最大，因此以其為參照峰。

2．6．2相似度評價(jià)采用計(jì)算機(jī)輔助相似度評價(jià)系統(tǒng)比較10批樣品HPLC圖譜全譜相似度，10批供試品相似度達(dá)到0．9以上。表明10批供試品具有較好的相似度。

3　小結(jié)

特征圖譜的相似性是通過色譜的整體性和模糊性來體現(xiàn)的，在不完全清楚樣品的所有成分時(shí)，特征圖譜相似性評價(jià)可以反映其內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。但是，在整體圖譜相似性良好的情況下，樣品所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異。因此，有必要在特征圖譜評價(jià)基礎(chǔ)上盡可能增加有效成分的含量測定，進(jìn)一步評價(jià)藥品質(zhì)量。

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Establishing specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides by HPLC

YANG Xianling1,XU Duoduo2,GAO Yang2*,LI Hongyue2,WANG Haiyang2

(1.Jilin Institute For Drug Control,Changchun 130033，China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides.MethodsThe monosaccharide composition of Milkvetch Root polysaccharides was determined by HPLC after preparing pre-column derivatization as PMP derivant.ResultsThere were 4 peaks from the specific chromatogram which were rhamnose,glucose,galactose and arabinose monosaccharide respectively.ConclusionThe HPLC method establishing specific chromatogram is a simple,rapid,sensitive and convenient,which can be applied to the quality control of Milkvetch Root polysaccharides.

Milkvetch root polysaccharides;rhamnose;monosaccharide;chromatogram;HPLC

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.014

中華人民共和國國家科技部“中藥提取物標(biāo)準(zhǔn)研究平臺建設(shè)”(2012ZX09304005004)。

楊獻(xiàn)玲(1980-),女,大學(xué)本科,主管藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與復(fù)核。

高陽,男,副研究員,電子信箱-gaoyang-1979@hotmail.com

R284.3

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2095-6258(2016)04-0701-03

2016-02-25)