楊梅黃酮對人成纖維細胞增殖及膠原合成的影響

謝　璟　鄭炎焱

楊梅黃酮對人成纖維細胞增殖及膠原合成的影響

謝璟鄭炎焱

目的： 明確楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞增殖及膠原合成的影響。方法： 原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞加入不同濃度（0，10，25，50，75，100 μM）的楊梅黃酮，流式細胞儀檢測細胞周期，MTT檢測細胞增殖活性和膠原合成。結果： 楊梅黃酮濃度為10 μM及25 μM時成纖維細胞增殖活性明顯增加；濃度高于50 μM處理后的成纖維細胞增殖活性降低，I型膠原表達減少。結論： 楊梅黃酮大于50 μM時能抑制成纖維細胞膠原合成，提示該藥具有較好的抗皮膚和內(nèi)臟器官纖維化作用，為治療纖維化相關疾病提供了一定的理論依據(jù)。

成纖維細胞；楊梅黃酮；膠原

楊梅黃酮廣泛存在于楊梅中，楊梅素（myricetin，Myr）化學名稱為3，5，7，3'，4'，5'-六羥基黃酮，是黃酮類化合物。廣泛存在于雙子葉植物，特別是一些木本植物的花和葉中，溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿、石油醚，近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、防止血小板聚集等多種生物活性［1，2］。有研究表明黃酮類藥物能依賴性地抑制細胞內(nèi)膠原合成，表明其在體外也有抗纖維化作用［3］，可為抗纖維化藥物研究提供理論依據(jù)。本研究結合纖維化的病理生理機制，從細胞及分子水平重點研究楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞增殖和膠原合成的影響，以尋找治療增生性瘢痕等纖維化相關疾病的有效藥物。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器 楊梅黃酮購自杭州和田生物技術有限公司，純度＞98%，將其用DMSO溶解，-20℃避光保存；二甲基亞砜（sigma公司）；MTT（sigma公司）；羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；人I型膠原試劑盒（美國Uscnlife公司）；ELITEESP流式細胞儀（Beckman公司）；DU-800型紫外分光光度計（美國Beckman公司）；PI染液（美國Beckman Coulter公司）。

1.2方法

1.2.1原代成纖維細胞的培養(yǎng) 材料取自健康男子包皮環(huán)切術切除的包皮，用組織塊法進行原代培養(yǎng)，實驗用第3～5代［4］。

1.2.2改良MTT比色法檢測細胞增殖和細胞毒性用不同濃度楊梅黃酮組（0，10，25，50，75，100 μM），處理人皮膚成纖維細胞24 h、48 h、72 h后，向每孔加入MTT溶液10 μL，選擇490 nm波長，在自動酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收（A）值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.3楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞（HSF）培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量影響的測定 將人皮膚成纖維細胞（HSF）以5×107/L的細胞密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積 1 mL，加入含不同濃度楊梅黃酮的DMEM培養(yǎng)液，每個試劑濃度測4個孔，加藥后48 h，從每個孔里各吸取 0.5 mL培養(yǎng)基，按羥脯氨酸（HPR）檢測試劑盒說明書方法操作，在酶標儀490 nm處檢測A值，樣品中羥脯氨酸質量濃度（μg/mL）=測定管A值×標準管濃度/標準液A值。

1.2.4對人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液中I型膠原蛋白影響的測定 取細胞培養(yǎng)上清液，按I型膠原檢測試劑盒說明書方法操作，在酶標儀450 nm處檢測得到I型膠原含量。

1.2.5楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞細胞周期影響的檢測 取第3～7代人皮膚成纖維細胞，以1×108/L的密度接種于直徑25 cm培養(yǎng)瓶中，待細胞長至60%～70%融合時，加入楊梅黃酮濃度分別為0，10，25，50，75，100 μM含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度2瓶細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3統(tǒng)計方法 全部資料用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件錄入和統(tǒng)計分析。正態(tài)分布資料用ˉx±s表示；對于重復測量的MTT值，采用重復測量資料的方差分析；對于人I型膠原蛋白測定值、羥脯氨酸值的分析，采用隨機區(qū)組設計資料的方差分析；當多個總體均數(shù)不全相同時，采用SNK法或LSD法進行多個樣本均數(shù)的兩兩比較。

2　結果

2.1不同濃度楊梅黃酮處理24 h、48 h、72 h后測量MTT值 應用MTT比色法測定人皮膚成纖維細胞增殖活力，結果見表1。與空白對照組相比，楊梅黃酮濃度為10，25 μM時人皮膚成纖維細胞增殖活力增加，濃度大于50 μM楊梅黃酮作用后人皮膚成纖維細胞增殖活力降低，差別具有非常顯著性意義（P＜0.01）。

表1　不同濃度楊梅黃酮處理后MTT值測定結果

表1　不同濃度楊梅黃酮處理后MTT值測定結果

加藥濃度（μM）　n　　不同時間的MTT值24 h　48 h　72 h 0　6　0.261±0.009　0.354±0.012　0.539±0.010 10　6　0.287±0.006　0.394±0.008　0.576±0.005 25　6　0.312±0.010　0.402±0.009　0.612±0.007 50　6　0.235±0.008　0.216±0.010　0.189±0.008 75　6　0.193±0.010　0.132±0.009　0.107±0.007 100　6　0.083±0.010　0.052±0.009　0.030±0.007

2.2I型膠原蛋白測定值分析 對不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細胞培養(yǎng)液中人I型膠原蛋白測定值進行方差分析。A、B、C三孔測定值的差異無統(tǒng)計學意義（F區(qū)組=1.815，P=0.213），不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細胞培養(yǎng)液中人I型膠原蛋白測定值的差異有統(tǒng)計學意義（F=539.848，P＜0.001），且各處理組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計學意義（SNK法，P＜0.05），其人I型膠原蛋白測定值隨楊梅黃酮加藥濃度（大于50 μM時）升高而逐漸變?。ū?）。

2.3不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細胞羥脯氨酸含量影響的方差分析 不同濃度楊梅黃酮對羥脯氨酸含量影響有統(tǒng)計學意義（F處理=379.711，P＜0.001），且各處理組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計學意義（SNK法，P＜0.05）。在楊梅黃酮濃度大于50 μM時，羥脯氨酸含量隨楊梅黃酮加藥濃度升高而逐漸減少（表3）。

表2　I型膠原蛋白測定值

表2　I型膠原蛋白測定值

藥物　不同加藥濃度I型膠原蛋白測定值0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM楊梅黃酮　2.9625±0.0328　3.1026±0.0602　3.2737±0.0146　1.8638±0.0413　1.6532±0.0180　0.5772±0.1375

表3　楊梅黃酮作用后成纖維細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量測定值

表3　楊梅黃酮作用后成纖維細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量測定值

藥物　　不同楊梅黃酮濃度中羥脯氨酸含量0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM楊梅黃酮　53.42±1.43　55.16±1.43　59.14±1.85　28.28±1.63　21.72±1.14　7.71±1.43

2.4楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞細胞周期的影響

用流式細胞儀分別測定0，50，75，100 μM楊梅黃酮作用48 h后成纖維細胞的細胞周期及各期所占的百分比，可以看出，濃度大于50 μM時隨著楊梅黃酮藥物濃度的增加，G/G期細胞數(shù)量增加，G/M期和S期細胞數(shù)量逐漸減少，細胞增殖指數(shù)（PI）逐漸減?。ū?）。

表4　成纖維細胞的細胞周期各期所占百分比

3　討論

纖維化（fibrosis）可發(fā)生于多種器官，主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續(xù)進展可致器官結構破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅人類健康和生命［5］。雖然組織纖維化誘發(fā)因素多樣、發(fā)生器官不同、臨床表現(xiàn)各異，但是它們的發(fā)生和發(fā)展都是因為組織損傷后組織修復過程失調(diào)或更直接地說是組織修復反應過度的結果。這些過度修復包括成纖維細胞的激活增殖及細胞外間質（ECM）-如膠原蛋白、蛋白多糖等成分過度的沉積等現(xiàn)象［6］。皮膚組織的纖維化可見于增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF），二者均是皮膚創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理現(xiàn)象，其病理本質是以成纖維細胞為主的細胞成分過度增殖和以膠原為主的細胞基質過度沉積，其中膠原主要由成纖維細胞合成分泌產(chǎn)生，因此后者的數(shù)量和功能狀態(tài)在很大程度上決定了增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF）纖維化的程度［7］，通過調(diào)控成纖維細胞（FB）凋亡有望成為有效防治病理性瘢痕的新亮點。本實驗采用不同濃度的楊梅黃酮，觀察楊梅黃酮對人皮膚成纖維細胞增殖和膠原合成的影響，以尋找治療人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的有效藥物。

黃酮類天然產(chǎn)物是近年來天然藥物和人類健康產(chǎn)品研究開發(fā)的熱點，從藥用植物和經(jīng)濟植物中開發(fā)生理活性黃酮成分作為天然藥物和保健品的原料已日益引起重視。楊梅為我國特產(chǎn)資源，鑒于地區(qū)差異，目前國際上對楊梅的研究剛剛起步，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、消除體內(nèi)自由基等多種藥理活性［8-11］。楊梅屬植物在我國分布較廣，不同種的不同部位均有入藥，其抗腫瘤、抗氧化活性研究較多，并取得了一些良好的成果，為楊梅黃酮抗纖維化研究提供理論依據(jù)。本研究結合纖維化的病理生理機制，從細胞及分子水平重點觀察楊梅黃酮抗成纖維細胞膠原合成作用。結果表明，楊梅黃酮在高濃度時可通過抑制成纖維細胞羥脯氨酸分泌，進而使細胞I型膠原蛋白的合成下降來干預纖維化進程；另外，高濃度楊梅黃酮還可通過影響人皮膚成纖維細胞周期，抑制靜止狀態(tài)的G1期細胞向S期轉變，使DNA合成量減少，從而抑制細胞的增殖。而在本實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮在低濃度時對成纖維細胞生長反而具有促進作用，可能與其抗氧化作用有關，具體機制有待進一步研究。

上述實驗說明楊梅黃酮在一定濃度范圍內(nèi)能抑制成纖維細胞膠原合成，提示該藥具有較好的的抗皮膚和內(nèi)臟器官纖維化作用，為其治療纖維化相關疾病提供了一定的理論依據(jù)。

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（收稿:2015-11-25 修回:2015-12-12）

Effect of myricetin on Proliferation and collagen synthesis of human fibroblasts

XIE Jing，ZHENG Yanyan.

Wenzhou People's Hospital，Wenzhou 325000，China

Objective:To determine the effect of myricetin on cell proliferation and collagen synthesis of human fibroblast.Methods:The primary cultured fibroblasts in vitro were isolated and treated with myricetin in different concentration（0，10，25，50，75，100 μM）.Cell cycle was measured by flow cytometry.The fibroblasts proliferation and the expression of collagen type I was assessed by MTT assay.Results:The cellular viability of fibroblast was increased in the dose of 10 μM and 25 μM of myricetin，and was decreased in the dose of 50 μM or above.Conclusion:The proliferation and collagen synthesis of human fibroblast can be inhibited when the concentration of myricetin is higher than 50 μM，which provides a theoretical base for the treatment of fibrosis diseases.

fibroblast；myricetin；collagen

溫州市科技計劃項目（編號:2014S0053）

浙江省溫州市人民醫(yī)院，325000