成年心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞去分化現(xiàn)象觀察

沈文艷，陳瑤，李軍

( 1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院,上海200217；2上海交通大學(xué)Med-X 臨床干細(xì)胞研究中心)

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成年心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞去分化現(xiàn)象觀察

沈文艷1，2，陳瑤2，李軍2

( 1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院,上海200217；2上海交通大學(xué)Med-X 臨床干細(xì)胞研究中心)

目的觀察成年心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞是否存在去分化現(xiàn)象。方法20只成年小鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組各10只，觀察組制備心肌梗死模型，對照組僅行假手術(shù)處理。采用RT-PCR法檢測兩組心肌組織 α-橫紋肌肌動蛋白(α-SA)、橫紋肌蛋白(α-actinin)、轉(zhuǎn)錄因子nkx2.5、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(mef2)、細(xì)胞增殖核抗原(Ki67)、干細(xì)胞標(biāo)記物血管內(nèi)皮生長因子受體(flk-1) mRNA，采用免疫熒光染色法檢測兩組心肌組織磷酸化組蛋白(PH3)、連接蛋白43(cx43)。結(jié)果觀察組心肌組織α-SA、α-actinin、nkx2.5、mef2 mRNA表達(dá)量均低于對照組，Ki67、flk-1、mRNA表達(dá)量及PH3、cx43均高于對照組，P均<0.05， 結(jié)論成年心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象。

心肌梗死；心肌細(xì)胞；細(xì)胞去分化；α-橫紋肌肌動蛋白；橫紋肌蛋白；轉(zhuǎn)錄因子；細(xì)胞增殖核抗原；磷酸化組蛋白

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是引起充血性心力衰竭的重要原因[1]。心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞因?yàn)槿毖獡p傷而失去了功能，心臟的泵血功能嚴(yán)重受損[2, 3]。目前常用治療心肌梗死的方法一般是藥物和介入治療，這些治療方法對已梗死的心肌無法修復(fù)。傳統(tǒng)上認(rèn)為，哺乳動物的心臟是一個終末分化器官[4]，而心肌細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，心肌梗死后心肌細(xì)胞沒有再生能力而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[5]。然而，最近越來越多的研究顯示新生小鼠及新生兒心肌均具有再生能力[6～8]。也有研究顯示，成體動物的心肌細(xì)胞可能也具有類似的能力[9]。連接蛋白43(cx-43)、 α-橫紋肌肌動蛋白(α-SA)、橫紋肌蛋白(α-actinin)、轉(zhuǎn)錄因子nkx2.5、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(mef2)是常用的心肌細(xì)胞標(biāo)記物，細(xì)胞增殖核抗原(Ki67)和磷酸化組蛋白(PH3)是常用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，血管內(nèi)皮生長因子受體(flk-1)是常用的干細(xì)胞標(biāo)記物。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死可以誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞在體外發(fā)生類似去分化的現(xiàn)象，但是體內(nèi)的研究目前尚未見報道。2013年5月～2014年3月，我們觀察了心肌梗死是否可誘導(dǎo)小鼠成體心肌細(xì)胞發(fā)生去分化現(xiàn)象?，F(xiàn)報告如下。

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1　材料與方法

1.1材料6～8周齡C57BL/6 SPF級雄性小鼠20只(體質(zhì)量22～25 g)，購自上海斯萊克模型動物有限公司；包埋劑OCT購自Sakura公司，1%SDS購自Sigma公司，Hanks平衡鹽溶液購自法國Biowest公司，脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購自Roche公司；鼠源抗小鼠細(xì)胞Ki67抗體購自美國BD公司，兔源抗小鼠PH3抗體購自美國Cell Signaling 公司，鼠源抗小鼠α-SA抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠cx43抗體購自美國CST公司；細(xì)胞核熒光染料 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Sigma公司，驢源抗兔Alexa Fluor488熒光染料，驢源抗兔Alexa Fluor555熒光染料均購自美國Invitrogen公司。引物由上海生工生物合成有限公司合成。

1.2小鼠心肌梗死模型制備將20只小鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組各10只。觀察組用異氟烷預(yù)麻箱麻醉后打開胸腔，于左心耳下緣約2 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，制備心肌梗死模型。以小鼠冠狀動脈左前降支供血區(qū)域心肌顏色變白[10]視為造模成功，最終造模成功10只。對照組僅麻醉后打開胸腔，不結(jié)扎血管行假手術(shù)處理。

1.3心肌組織α-SA、α-actinin、nkx2.5、mef2、Ki67、flk-1 mRNA表達(dá)檢測采用RT-PCR法。造模7 d取兩組小鼠，斷頭處死后取心肌組織;按照試劑盒說明書提取出總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。引物序列：β-actin上游引物5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，引物長度154 bp；Ki67上游引物5′-CCTGCCCGACCCTACAAAAT-3′，下游引物5′-TCCGCCGTCTTAAGGTAGGA-3′,引物長度313 bp；flk-1上游引物5′-AGAGTCAGACAACAACAATTGGCGAGAC-3'，下游引物5′-GCATCATAAGGCAAGCGTTCACAGC-3′，引物長度451 bp；Nkx2.5上游引物5′-CAATGCCTATGGCTACAACGC-3′，下游引物5′-GAGTCATCGCCCTTCTCCTAAA-3′，引物長度297 bp；α-SA上游引物5′-CAGCCCTCTTTCATTGGT-3′，下游引物5′-CTGCCTCATCATACTCTT-3′，引物長度310 bp；mef上游引物5′-AAGTACACCGAGTACAACG-3′，下游引物5′-TAACTGGCATCTCAAAGC-3′，引物長度235 bp；α-actinin上游引物5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACCTTC-3′，下游引物5′-CATTATGAGTTACACCATCGCCAGA-3′，引物長度130 bp。 反應(yīng)體系 30 μL, 擴(kuò)增條件：72 ℃、45 s延伸， 95 ℃ 、30 s，55 ℃、30 s，30個循環(huán)，72 ℃、10 min，4 ℃冷卻，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用Image J軟件分析目的條帶灰度，以其與β-actin的灰度比值計算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4心肌組織PH3、cx43表達(dá)檢測采用免疫熒光染色法。取造模7 d時兩組小鼠心肌組織， OCT包埋切片，驢血清封閉;用1%BSA稀釋抗體(1∶100)一抗孵育，4 ℃ 過夜。次日37 ℃復(fù)溫45 min，二抗孵育后洗滌。DAPI復(fù)染，封片，采用熒光顯微鏡觀察心肌組織PH3、cx43染色結(jié)果。用Image J軟件分別測免疫熒光結(jié)果中陽性熒光面積比上該視野的面積，計算相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1兩組心肌組織α-SA、α-actinin、nkx2.5、mef2、Ki67、flk-1 mRNA表達(dá)比較見表1。

2.2兩組心肌組織PH3、cx43表達(dá)比較見表2。

表1　造模7 d兩組心肌組織α-SA、α-actinin、nkx2.5、mef2、Ki67、flk-1 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

3　討論

長期以來，人們認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，自身沒有再生能力。有研究顯示,心肌細(xì)胞可以被誘導(dǎo)再分裂，使心肌細(xì)胞去分化，重新進(jìn)入細(xì)胞周期[11]。新生的心肌細(xì)胞也可以通過去分化的方式參與心臟自穩(wěn)態(tài)的維護(hù)和病變組織的修復(fù)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠心肌細(xì)胞可在急性損傷后發(fā)生去分化現(xiàn)象，以保證在存活基礎(chǔ)上在特定條件下進(jìn)一步再生為心肌細(xì)胞。

表2　造模7 d兩組心肌組織PH3、cx43相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模7 d觀察組心肌組織cx-43、α-SA及α-actinin mRNA相對表達(dá)量均低于對照組，提示心肌肌節(jié)解聚現(xiàn)象明顯，心肌細(xì)胞橫紋肌結(jié)構(gòu)破壞。 Nkx2.5和mef2是兩個與心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Nkx2.5參與了心臟形成,包括右側(cè)環(huán)化、心腔分化、心臟間隔功能成熟以及工作心肌和傳導(dǎo)系統(tǒng)的維持等過程[13]。心肌梗死后nkx2.5和mef2的表達(dá)減少，提示心肌梗死后成熟心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，退回到未成熟心肌細(xì)胞或前體細(xì)胞狀態(tài)。我們前期研究顯示,心肌梗死后小鼠的心肌細(xì)胞有Ki67表達(dá)的增加，并與乳鼠心肌組織表達(dá)接近，進(jìn)一步說明心肌梗死后部分心肌細(xì)胞的增殖能力可能退回到接近乳鼠未成熟心肌細(xì)胞或前體細(xì)胞的階段。在正常成體組織中，絕大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)，細(xì)胞學(xué)上稱為G0期。要構(gòu)建良好的組織結(jié)構(gòu)并執(zhí)行特定的功能，必須依靠這些增殖周期外的G0期細(xì)胞。Ki67免疫組化染色可將大部分G0期以外的增殖細(xì)胞標(biāo)記，因而也被稱為細(xì)胞的增殖指數(shù)。Ki67陽性率越高，說明處于增殖周期的細(xì)胞比例越高，組織分化越好。PH3只出現(xiàn)于有絲分裂期細(xì)胞染色體，靜止期細(xì)胞不表達(dá),PH3表達(dá)的增高可以更準(zhǔn)確地提示心肌梗死誘導(dǎo)成體心肌細(xì)胞增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組心肌組織存在Ki67和PH3高表達(dá)，與以往研究結(jié)果一致。flk-1是啟動胚胎造血發(fā)育的必需基因。Shalaby等[15]報道,flk-1基因能調(diào)節(jié)早期中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞遷移至造血微環(huán)境；Miyagi等[16]發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞體外發(fā)育至表達(dá)flk-1階段已具備重建造血功能，flk-1基因敲除的胚胎干細(xì)胞不能發(fā)育為造血細(xì)胞。本研究中，觀察組心肌組織中flk-1相對表達(dá)量明顯高于對照組，進(jìn)一步提示心肌梗死后心肌細(xì)胞退回至未成熟心肌細(xì)胞或前體細(xì)胞階段。

綜上所述，成年心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象，但其具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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(收稿日期：2016-01-15)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81300088)。

李軍(E-mail: jun.li@sjtu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.011

R544.22

A

1002-266X(2016)18-0034-03

2016-01-20)