微弧氧化處理對(duì)鈦片表面人成骨細(xì)胞附著、增殖及活性的影響

馬敏先，周震，王永，楊靜，張俊標(biāo)，劉琴，王梅

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽550004；2廣東省口腔醫(yī)院；3貴陽市口腔醫(yī)院)

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微弧氧化處理對(duì)鈦片表面人成骨細(xì)胞附著、增殖及活性的影響

馬敏先1，周震2，王永1，楊靜1，張俊標(biāo)1，劉琴1，王梅3

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽550004；2廣東省口腔醫(yī)院；3貴陽市口腔醫(yī)院)

目的觀察微弧氧化(MAO)處理對(duì)鈦片表面人成骨細(xì)胞附著、增殖及活性的影響。方法將90片鈦片分為觀察組、對(duì)照組和空白組各30片，觀察組和對(duì)照組分別采用MAO法、雙氧水處理，空白組為純鈦對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人成骨細(xì)胞100 μL細(xì)胞懸液涂布于各組鈦片表面。分別于培養(yǎng)1、2、3、6、7、8 d采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)鈦片表面附著成骨細(xì)胞數(shù)，采用MTT法測(cè)定培養(yǎng)1、2、3、6 d各組細(xì)胞增殖抑制率，采用ALP試劑檢測(cè)各組培養(yǎng)3、6 d時(shí)ALP活性。結(jié)果培養(yǎng) 3、6、7、8 d，鈦片表面附著人成骨細(xì)胞數(shù)均觀察組>對(duì)照組>空白組，P均<0.05。培養(yǎng)3、6 d時(shí)，細(xì)胞增殖率均觀察組>對(duì)照組>空白組，P均<0.05。培養(yǎng)3、6 d時(shí)ALP活性均觀察組>對(duì)照組>空白組，P均<0.05。結(jié)論MAO處理鈦片與人成骨細(xì)胞生物相容性較好，可促進(jìn)人成骨細(xì)胞早期附著和細(xì)胞增殖，提高ALP活性。

成骨細(xì)胞；微弧氧化法；純鈦；生物相容性；堿性磷酸酶

目前，鈦片表面化學(xué)成分的改變是口腔種植體研究的熱點(diǎn)，可使商業(yè)純鈦轉(zhuǎn)化為生物活性材料[1,2]，在種植體表面形成一層生物活性膜或涂層, 最終誘導(dǎo)骨組織形成，達(dá)到生物化學(xué)結(jié)合[3～5]。但是，成骨細(xì)胞附著數(shù)量、增殖活性是能否成功的基礎(chǔ)，附著成骨細(xì)胞是否具有成骨細(xì)胞活性是關(guān)鍵，堿性磷酸酶(ALP)常用于成骨功能活性檢測(cè)。微弧氧化(MAO)技術(shù)是專門用于鋁、鈦、鎂等金屬進(jìn)行表面處理的一種新技術(shù)，能在金屬表面形成一層含有不同比例鈣磷元素粗糙多孔又耐腐蝕的氧化層,水熱處理后還可在金屬氧化層上沉積羥基磷灰石晶體[6], 使其具有生物活性。2012年9月～2015年6月，我們采用MAO法處理鈦片，并用其體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，觀察細(xì)胞的附著能力、增殖及活性，旨在探討MAO應(yīng)用于鈦植入材料表面處理的可能性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料人成骨細(xì)胞來自我院計(jì)劃生育科，于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。TA2純鈦片(直徑10 mm，深圳全宇鈦業(yè)代理山西寶鈦)；MAO-1脈沖直流微弧氧化電源設(shè)備(成都普斯特電源有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Bio-Tek E1312E酶標(biāo)光度儀、24孔培養(yǎng)板(美國(guó)Forma Scientific 公司) , 一次性微孔濾膜濾器(愛爾蘭Carrighwohill公司)，胎牛血清(FCS) 、DMEM培養(yǎng)基 (美國(guó)GIBCO公司),乙二胺四乙酸(EDTA，以色列SIGMA公司), 胰蛋白酶(美國(guó)DIFCO公司), MTT試劑檢測(cè)盒(南京建成生物有限公司 ), 二甲基亞砜(DMSO，武漢博士德公司),ALP試劑檢測(cè)盒(南京建成生物有限公司), Ⅱ型膠原酶(美國(guó)GIBCO公司), 丙酮(成都科龍化工試劑廠, 分析純), 600目砂(上海鉆石牌), 乙酸鈣(無錫陽山生化有限公司, 分析純), 磷酸二氫鈉(嘉興市昌利化工有限公司, 分析純)。

1.2鈦片處理及分組 將TA2純鈦片線切割加工成厚1 mm圓鈦片，以金相砂紙逐級(jí)打磨至600目，清洗后得到光滑鈦片。然后用石油醚、乙醇和去離子水在超聲清洗器(KQ250)中輪流清洗3次，以除去材料表面機(jī)械加工時(shí)而殘留的油污。將處理后鈦片分為觀察組、對(duì)照組和空白組組。觀察組將鈦片置入微弧氧化設(shè)備中，以0.2 mol/L磷酸二氫鈉和0.4 mol/L乙酸鈣作為電解液，將純鈦片作為陽極浸入電解液中，不銹鋼槽作為陰極，接入平均電壓150 V，頻率300 Hz，占空系數(shù)20%，處理時(shí)間為120 s，電流密度3 A/dm2。同時(shí)不斷攪拌電解液，使槽溫控制于30 ℃左右，制備得MAO處理鈦片。對(duì)照組使用5.80 mol/L HCl和8.96 mol/L H2SO4混合液處理10 min，雙蒸水沖洗，50℃干燥；8.8 mol/L H2O2、80 ℃處理30 min，400 ℃熱處理1 h，制備得到雙氧水處理鈦片?？瞻捉M為純鈦,不做任何處理。每組各30片鈦片。處理完畢后采用鈦片掃描電子顯微鏡觀察各組鈦片情況，鏡下可見觀察組純鈦表面粗糙不平，有大小不一類似蜂窩狀微孔，微孔周圍有類似火山丘狀形態(tài)，這些孔互相不連通，孔徑較均勻；對(duì)照組純鈦表面粗糙不平；空白組純鈦表面可見明顯的劃痕。

1.3人成骨細(xì)胞的接種分別取各組鈦片，置于24孔板內(nèi)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人成骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL;各取100 μL細(xì)胞懸液涂布于上述鈦片表面，6 h后每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，置于CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4鈦片表面附著人成骨細(xì)胞數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板。分別于培養(yǎng)1、2、3、6、7、8 d取各組鈦片培養(yǎng)板，每組4孔，Hanks液沖洗3遍，置于另一塊潔凈12孔板內(nèi)；胰蛋白酶消化3 min，收集上層清液；1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，混勻后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算為每微升懸液所含細(xì)胞數(shù)。

1.5人成骨細(xì)胞增殖檢測(cè)采用MTT法。分別于培養(yǎng)1、2、3、6 d取各組鈦片培養(yǎng)板，每組4孔，加入MTT培養(yǎng)液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h;棄去培養(yǎng)液后取出試件，于另一培養(yǎng)板中放置?？瞻捉M棄去培養(yǎng)液即可。然后加入DMSO 1.0 mL/孔，振蕩10 min，測(cè)波長(zhǎng)490 nm的光密度(OD)值，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(觀察組OD值-陰性對(duì)照OD值)/陰性對(duì)照OD值×100%。

1.6人成骨細(xì)胞ALP活性測(cè)定取各組鈦片培養(yǎng)板，每組4孔，加入含有維生素C 50 mg/mL、磷酸甘油鈉10 mmol/L、地塞米松10 mmol/L的礦化液培養(yǎng)；分別于培養(yǎng)3、6 d，棄去培養(yǎng)液,Hanks沖洗3次；加入TritonX100 μL(2 mol/L),4 ℃冰箱過夜。再加入ALP底物150 μL，37 ℃環(huán)境保持30min，以KOH 100 μL/孔(0.1 mol/L)中止反應(yīng)。測(cè)波長(zhǎng)410 nm的OD值以此代表細(xì)胞ALP活性。為除外細(xì)胞增殖抑制率的不同對(duì)ALP活性影響，采用ALP測(cè)得OD值/同期成骨細(xì)胞增殖率進(jìn)行修正。

2　結(jié)果

2.1各組鈦片表面附著人成骨細(xì)胞數(shù)比較見表1。

注：與空白組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05.

2.2各組細(xì)胞增殖率比較見表2。

表2　各組細(xì)胞增殖率比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3各組細(xì)胞ALP 活性比較見表3。

表3　培養(yǎng)3、6 d時(shí)各組ALP活性比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3　討論

種植體種植成功的關(guān)鍵在于形成良好的種植體-骨性界面的結(jié)合，即骨整合。骨整合是指種植體表面和周圍健康骨組織之間沒有任何纖維結(jié)締組織間隔的直接連接，具有分散功能性負(fù)重的能力，且不會(huì)對(duì)鄰近組織及全身產(chǎn)生不利影響。骨-種植體的骨整合是代謝活躍的骨組織和具有生物相容性的金屬這兩種不同材料的結(jié)合，除患者生理?xiàng)l件、可用骨量等宿主因素和手術(shù)損傷的負(fù)重時(shí)機(jī)等醫(yī)源性因素以外，最主要的影響因素就是處理后種植體表面生物黏附力、表面張力、表面親水性、骨組織親和力和電勢(shì)能等[7，8]。因此，粗糙且具有生物活性的種植體界面尤為重要。Ward 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞在粗糙面上的黏附性能更好，而且可以沉淀更多的鈣、磷元素。因此，均勻多孔的表面形貌將增加材料表面的粗糙度，有利于鈦合金與骨組織形成強(qiáng)的化學(xué)連接。

鈦片是加工后的矢量式金屬片，機(jī)械強(qiáng)度高，比重小，有較好生物相容性，目前已廣泛用于醫(yī)療行業(yè)。雙氧水法在反應(yīng)表面可形成一層具有生物活性的二氧化鈦凝膠層,該層在體外模擬體液中具有誘導(dǎo)形成羥基磷灰石的能力[10]。王永等[11]發(fā)現(xiàn)雙氧水處理組的優(yōu)于各傳統(tǒng)粗化及酸蝕處理組,采用雙氧水法處理可以更有效促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞在純鈦表面的附著、增殖，并提高大鼠成骨細(xì)胞的ALP活性。但雙氧水法操作復(fù)雜，設(shè)備要求較高，且處理后鈦片與成骨細(xì)胞相容性較低。MAO法是通過電解液和相關(guān)的電參數(shù)進(jìn)行組合，可在鈦金屬表面通過弧光放電瞬時(shí)產(chǎn)生高溫高壓而產(chǎn)生以基底金屬氧化物為主的一層陶瓷膜[12,13]，即二氧化鈦氧化膜;且陶瓷膜鈣磷元素比例合適，有利于羥基磷灰石的形成，從而增強(qiáng)骨細(xì)胞與材料表面的良好結(jié)合[14,15]，防止出現(xiàn)種植體表面活性膜脫落而造成的種植體植入后失敗。

相對(duì)于附著和增殖情況,成骨細(xì)胞在材料表面的功能更為重要。ALP是成骨細(xì)胞礦化過程中主要的功能活性酶[16,17]，其可以間接反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)[18,19]。因此，ALP被普遍認(rèn)為能夠反映成骨細(xì)胞形成骨基質(zhì)的能力,是成骨細(xì)胞分化和功能的重要標(biāo)志[20,21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1 d時(shí)，成骨細(xì)胞已附著在各組鈦片表面,但細(xì)胞數(shù)目變化不大,為細(xì)胞的潛伏適應(yīng)期;從培養(yǎng)2 d起,細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至培養(yǎng)6 d達(dá)到高峰；培養(yǎng)6 d后細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平緩期。培養(yǎng) 3、6、7、8 d時(shí)鈦片表面附著人成骨細(xì)胞數(shù)均觀察組>對(duì)照組>空白組，培養(yǎng)、3、6 d時(shí)細(xì)胞增殖率均觀察組>對(duì)照組>空白組，培養(yǎng)3、6 d時(shí)ALP活性均觀察組>對(duì)照組>空白組。說明MAO法處理鈦片與人成骨細(xì)胞生物相容性較好，可提高人成骨細(xì)胞早期附著，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高ALP活性，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of microarc oxidation on adhesion, proliferation and cell activity of osteoblasts on pure titanium surface

MAMinxian1,ZHOUZheng,WANGYong,YANGJing,ZHANGJunbiao,LIUQin,WANGMei

(1AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the effects of microarc oxidation (MAO) on the adhesion, proliferation and ALP activity of osteoblasts on pure titanium surface.MethodsNinety samples of pure titanium were divided into three groups: the observation group, control group and the blank group, 30 in each group. The observation group and control group were treated by MAO and hydrogen peroxide, and the blank group was pure titanium. The titanium surface was coated in 100 μL cell suspension of osteoblasts in the logarithmic phase. On day 1, 2, 3, 6, 7 and 8, the blood counting chamber was used to count the number of osteoblasts adhering on the surface of the titanium plate, and MTT was used to determine the cell proliferation rate on day 1, 2, 3 and 6 in each group, and alkaline phosphatase was used to detect the ALP activity on day 3 and 6.ResultsOn day 3, 6, 7 and 8, the number of osteoblasts adhering on the surface of the titanium plate: the observation group>the control group> the blank group, allP<0.05. The cell proliferation rate on day 3 and 6: the observation groupthe control group> the blank group, allP<0.05.ConclusionTitanium surface treated with MAO exhibits better biocompatibility, which can effectively improve the adhesion of osteoblasts in the early stage, promote the cell prolferation and improve the ALP activity.

osteoblasts; microarc oxidation; pure titanium; biocompatibility; alkaline phosphatase

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔省專合-2010-83號(hào))。

馬敏先(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榭谇环N植及修復(fù)的臨床教學(xué)及科研。E-mail： 156722229@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.008

R783

A

1002-266X(2016)18-0025-04

2015-09-24)