藍(lán)莓花青素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化、增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討

王麗，何萍，孫建超，王豫萍，程明亮

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004)

?

藍(lán)莓花青素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化、增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討

王麗，何萍，孫建超，王豫萍，程明亮

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004)

目的觀察藍(lán)莓提取物花青素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化、增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組、空白組，觀察組先加入600 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)24 h后，加葡萄糖氧化酶(GO)100 U/L孵育3 h，對(duì)照組加入GO 100 U/L孵育3 h,空白組不做任何處理。干預(yù)24 h時(shí)采用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)各組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，ELISA法檢測(cè)胞質(zhì)Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)；采用MTT法觀察各組細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞凋亡情況；采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組胞質(zhì)丙二醛(MDA)，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組胞質(zhì)SOD，微量酶標(biāo)法測(cè)定各組胞質(zhì)谷胱甘肽(GSH)。結(jié)果干預(yù)24 h時(shí)，各組α-SMA相對(duì)表達(dá)量為空白組<觀察組<對(duì)照組，P均<0.05。干預(yù)24 h時(shí)，觀察組細(xì)胞增殖率低于對(duì)照組，P<0.05。干預(yù)24 h時(shí)，觀察組細(xì)胞凋亡率高于其余兩組，P均<0.05。干預(yù)24 h時(shí)，觀察組胞質(zhì)MDA低于對(duì)照組(P<0.05)，SOD、GSH均高于空白組(P均<0.05)。結(jié)論藍(lán)莓花青素可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化與增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與抑制胞質(zhì)內(nèi)MDA表達(dá)，促進(jìn)SOD、GSH表達(dá)有關(guān)。

肝星狀細(xì)胞；藍(lán)莓；花青素；氧化應(yīng)激；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；Ⅰ型膠原；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))過度沉積，是機(jī)體對(duì)各種病因引起的慢性肝損傷后一種損傷性修復(fù)反應(yīng)[1]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝損害的重要機(jī)制之一[2, 3]。肝星狀細(xì)胞(HSC)活化和增殖可促進(jìn)肝纖維化[4]，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(ColⅠ)是臨床常用的細(xì)胞活化指標(biāo)。藍(lán)莓富含花青素、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化成分。其中花青素具有抗氧化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝臟、降低DNA氧化損傷的功能[5, 6]，是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓可預(yù)防CCl4所致的大鼠急、慢性肝損傷[7～9]，但其具體有效成分目前尚不明確。2015年4～12月，我們觀察了藍(lán)莓花青素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化、增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料HSC-T6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院(貨號(hào)：BRL3A)；藍(lán)莓由貴州省麻江縣藍(lán)莓生產(chǎn)基地提供，由中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)化學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室提取藍(lán)莓花青素[10]。胎牛血清(杭州四季青公司)，低糖DMEM(Hyclone公司)，葡萄糖氧化酶(GO，美國(guó)Sigma公司)，MTT(美國(guó)Sigma公司)，α-SMA單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(中杉金橋公司)；二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)，蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶公司)，ColⅠ試劑盒(武漢基因美生物公司)，丙二醛(MDA)、SOD、胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物公司)，Annexin V、 FITC凋亡試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。二氧化碳培養(yǎng)箱(WJ-3，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，倒置顯微鏡(CKX41+DP25,日本Olympas公司)，熒光顯微鏡(日本Olympas公司)，超純水儀(英國(guó)ELGA公司)，-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，YHF7F-1LCantoTMⅡ流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)。

1.2HSC-T6分組及處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的適量HSC-T6常規(guī)復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中隔天換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代。以7.5×103/孔接種于96孔板中，將細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組、空白組，觀察組先加入600 μg/mL藍(lán)莓花青素干預(yù)24 h后，加GO 100 U/L孵育3 h，對(duì)照組加入GO 100 U/L孵育3 h,空白組不做任何處理，三組均置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

1.3HSC-T6活化情況觀察干預(yù)24 h時(shí),采用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)HSC-T6中α-SMA表達(dá)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞,4×104/mL接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔。PBS輕洗，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100破膜，羊血清封閉；加入α-SMA一抗(1∶100)4 ℃過夜，Envision二步法顯色。胞質(zhì)染成棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，采用Image-pro-plus分析積分光密度(IOD)，以IOD值代表α-SMA的相對(duì)表達(dá)量。干預(yù)24 h時(shí)，采用ELISA法檢測(cè)HSC-T6胞質(zhì) ColⅠ含量。另取各組細(xì)胞12×104/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，PBS沖洗，利用蛋白提取試劑盒提取胞質(zhì)蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)HSC-T6胞質(zhì)ColⅠ的相對(duì)表達(dá)量，所有操作嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

1.4HSC-T6增殖情況觀察采用MTT法。干預(yù)24 h時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞接種于96孔板，7.5×103/孔，每組6個(gè)復(fù)孔。用PBS輕洗，加入低糖DMEM 180 μL和5 mg/mL MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h。棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用酶標(biāo)儀測(cè)量各組在490 nm處的光密度(OD)值，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(觀察組OD值-陰性對(duì)照OD值)/陰性對(duì)照OD值×100%。

1.5HSC-T6凋亡情況觀察采用流式細(xì)胞儀。干預(yù)24 h時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。各取100 μL加入 Annexin V FITC結(jié)合物和PI Solution各5 μL，渦旋混勻后避光溫孵育15 min。48 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，采用BD FACSDIVA軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6HSC-T6胞質(zhì)MDA、SOD、GSH蛋白檢測(cè)干預(yù)24 h時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組胞質(zhì)MDA含量；黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組胞質(zhì)SOD活性；微量酶標(biāo)法測(cè)定各組胞質(zhì)GSH含量，所有操作嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。各組均隨機(jī)選取30個(gè)視野采集圖像，用以上MDA、SOD、GSH的陽(yáng)性與所占整個(gè)圖像的百分比來表示MDA、SOD、GSH的表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1 各組α-SMA及胞質(zhì)ColⅠ表達(dá)比較干預(yù)24 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組、空白組α-SMA相對(duì)表達(dá)量分別為0.032±0.007、0.053±0.002、0.013±0.005;組間比較，P均<0.05。干預(yù)24 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組、空白組胞質(zhì)ColⅠ相對(duì)表達(dá)量分別為808.47±10.14、1 037.04±106.47、687.47±11.4；對(duì)照組高于空白組(P<0.05)，觀察組低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞增殖率比較干預(yù)24 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組、空白組的細(xì)胞增殖率分別為0.830%±0.061%、1.050%±0.06%、0.800%±0.015%，觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，觀察組細(xì)胞增殖率與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.517)。

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較干預(yù)24 h時(shí)，觀察組、對(duì)照組、空白組細(xì)胞凋亡率分別為64.03%±1.50%、39.03%±1.57%、36.5%±0.70%，觀察組細(xì)胞凋亡率高于其余兩組(P均<0.05)，對(duì)照組與空白組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4各組胞質(zhì)MDA、SOD、GSH表達(dá)比較見表1。

表1　干預(yù)24 h時(shí)各組胞質(zhì)MDA、SOD、GSH表達(dá)量比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，△P<0.05。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中造成HSC激活的一個(gè)重要因素。受損肝細(xì)胞損傷部位聚集的炎性細(xì)胞和激活的Kuffer細(xì)胞均釋放活性氧簇(ROS)，ROS可通過旁分泌方式激活HSC，并導(dǎo)致HSC進(jìn)一步釋放ROS，致使HSC細(xì)胞增殖、產(chǎn)生大量膠原蛋白、基質(zhì)降解失衡、增強(qiáng)血管收縮性、增加肝內(nèi)血流壓力等，從而加快肝纖維化形成進(jìn)程。以往研究認(rèn)為，肝纖維化逆轉(zhuǎn)主要與激活狀態(tài)HSC轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)有關(guān);但I(xiàn)redale等[11]研究認(rèn)為，活化HSC數(shù)量減少與凋亡有關(guān)。HSC凋亡可使活化HSC數(shù)量減少，膠原蛋白合成減少，使肝纖維化得以逆轉(zhuǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素、草蓯蓉等生物堿和黃酮類化合物可通過減輕細(xì)胞過氧化損傷、抑制肝細(xì)胞凋亡從而抑制HSC活化或者促進(jìn)活化型HSC凋亡[12,13]。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志[14]，常作為HSC激活標(biāo)志物。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致HSC合成以ColⅠ及Col Ⅲ為主的多種細(xì)胞外基質(zhì)[15]，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為氧化與抗氧化反應(yīng)失衡，其中MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，是連接氧化應(yīng)激損傷與肝纖維化之間的橋梁，MDA含量高低間接反映細(xì)胞氧化損傷程度[16]。初級(jí)抗氧化防御系統(tǒng)主要分為酶類和非酶類抗氧化系統(tǒng)，其代表物質(zhì)分別為SOD、GSH。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。GSH是一種由3個(gè)氨基酸組成的小分子肽，是體內(nèi)重要的抗氧化劑和ROS清除劑，可與ROS、重金屬等結(jié)合，把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)排泄出體外。

野生藍(lán)莓富含花青素，花青素是一種特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是種天然抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的心肌損傷[13]。陳琦等[17]研究發(fā)現(xiàn),花青素對(duì)正常細(xì)胞也具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。王琴等[18]研究發(fā)現(xiàn)，600 μg/mL紫甘薯花色苷對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到90.69%。本課題組前期研究表明，藍(lán)莓可通過下調(diào)Bcl-2、降低Bcl-2/Bax值誘導(dǎo)HSC凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)24 h時(shí)各組α-SMA相對(duì)表達(dá)量為空白組<觀察組<對(duì)照組,說明氧化應(yīng)激模型制作成功；干預(yù)24 h時(shí)，觀察組細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組,干預(yù)24 h時(shí)觀察組細(xì)胞凋亡率明顯高于其余兩組，干預(yù)24 h時(shí)，觀察組SOD、GSH均高于空白組，說明花青素可降低MDA,減輕肝細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)SOD與GSH表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化能力。

綜上所述，藍(lán)莓花青素可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC活化、增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與抑制胞質(zhì)MDA表達(dá)且促進(jìn)SOD、GSH表達(dá)有關(guān)。

[1] Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury [J]. J Biol Chem, 2000,275(4):2247-2250.

[2] Poli G. Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress [J]. Mol Aspects Med, 2000,21 (3):79-98.

[3] Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Stimulation and proliferation of primary rat hepatic stellate cells by cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species [J]. Hepatology, 2002,35(1):62-73.

[4] Gebhardt R. Oxidative stress, plant-derived antioxidants and liver fibrosis [J]. Planta Med, 2002,68(4):289-296.

[5] Del BC, Riso P, Campolo J, et al. A single portion of blueberry (Vaccinium corymbosum L) improves protection against DNA damage but not vascular function in healthy male volunteers [J]. Nutr Res, 2013,33(3):220-227.

[6] Adams LS, Phung S, Yee N, et al. Blueberry phytochemicals inhibit growth and metastatic potential of MDA-MB-231 breast cancer cells through modulation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway [J]. Cancer Res, 2010,70(9):3594-3605.

[7] Wang Y, Cheng M, Zhang B, et al. Dietary supplementation of blueberry juice enhances hepatic expression of metallothionein and attenuates liver fibrosis in rats [J]. PLoS One, 2013,8(3):58659.

[8] Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effect of blueberry on hepatic and immunological functions in mice [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010,9(2):164-168.

[9] Wang YP, Cheng ML, Zhang BF, et al. Effects of blueberry on hepatic fibrosis and transcription factor Nrf2 in rats [J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(21):2657-2663.

[10] 劉仁道,張猛. 藍(lán)莓果實(shí)花青素提取及定量方法的比較[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(5):655-660.

[11] Iredale JP, Benyon RC, Pickering J, et al. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepatic expression of metalloproteinase inhibitors [J]. J Clin Invest, 1998,102(3):538-549.

[12] Wang Y, Wang R, Wang Y, et al. Ginkgo biloba extract mitigates liver fibrosis and apoptosis by regulating p38 MAPK, NF-kappaB/IkappaBalpha, and Bcl-2/Bax signaling [J]. Drug Des Devel Ther, 2015(9):6303-6317.

[13] He YJ, Kuchta K, Lv X, et al. Curcumin, the main active constituent of turmeric (Curcuma longa L.), induces apoptosis in hepatic stellate cells by modulating the abundance of apoptosis -related growth factors [J]. Z Naturforsch C, 2015,70(11-12):281-285.

[14] Sato M, Suzuki S, Senoo H. Hepatic stellate cells: unique characteristics in cell biology and phenotype[J]. Cell Struct Funct, 2003,28(2):105-112.

[15] Brown B, Lindberg K, Reing J, et al. The basement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix [J]. Tissue Eng, 2006,12(3):519-526.

[16] Cassiman D, Libbrecht L, Desmet V, et al. Hepatic stellate cell/myofibroblast subpopulations in fibrotic human and rat livers [J]. J Hepatol, 2002, 36(2):200-209.

[17] 陳琦,王利,李少偉,等. 藍(lán)莓花青素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖與凋亡作用[J].生物技術(shù),2013，23(5)：38-42.

[18] 王琴,溫其標(biāo).紫甘薯花色苷光譜特性及抗氧化性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(11)：67-72.

[19] 陸爽,程明亮,楊德猛，等.藍(lán)莓對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞T6凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2015，95(31)：35-38.

Effects of blueberry anthocyanins on activation and proliferation of oxidative stress-induced rat hepatic stellate cells

WANGLi,HEPing,SUNJiangchao,WANGYuping,CHENGMingliang

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of blueberry anthocyanins on the activation, proliferation and apoptosis of oxidative stress-induced rat hepatic stellate cells (HSC-T6) and the correlated mechanisms. MethodsHSC-T6 cells in the logarithmic phase were divided into the observation group, control group and the blank group, respectively. The observation group was incubated with 100 μg/mL U/L GO for 3 hours after blueberry anthocyanin intervention of 24 hours, the control group was incubated with 100 U/L GO for 3 hours, and the blank group without any treatment. After 24-hour intervention, the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSC-T6 cells was measured by immunohistochemistry, the cytosolic collagen I (Col I) level was detected by ELISA, the cell proliferation was detected by MTT, the apoptosis of HSC-T6 was detected by flow cytometry, the level of MDA was measured by thiobarbituric acid method, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of GSH were detected by xanthine oxidase and enzyme linked immunosorbent assay, respectively. ResultsAfter intervention of 24 h, the expression level of α-SMA in each group was blank group

hepatic stellate cells; blueberry; anthocyanins; oxidative stress; α-smooth muscle actin; collagen I; cell proliferation; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460125)；貴州省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目(20151010)；貴州省科技廳中藥現(xiàn)代項(xiàng)目(黔科合ZY字-2012-3017)；貴州省省長(zhǎng)基金項(xiàng)目(黔省專合字2012-44)。

王麗(1987-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楦卫w維化的治療。E-mail： 81393551@qq.com

簡(jiǎn)介：程明亮(1957-)，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)楦卫w維化及病毒性肝炎的治療。E-mail： chengml@21cn.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.003

R575.2

A

1002-266X(2016)18-0008-03

2016-01-06)