日糧硝酸鹽水平對湖羊瘤胃硝態(tài)氮動態(tài)消失率、發(fā)酵參數(shù)及血液高鐵血紅蛋白含量的影響

陳志遠(yuǎn)，馬婷婷，方　偉，左曉昕，林　淼，趙國琦（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009）

日糧硝酸鹽水平對湖羊瘤胃硝態(tài)氮動態(tài)消失率、發(fā)酵參數(shù)及血液高鐵血紅蛋白含量的影響

陳志遠(yuǎn)**，馬婷婷**，方偉，左曉昕，林淼*，趙國琦*
（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009）

本試驗研究日糧硝酸鹽的添加量對湖羊瘤胃還原硝態(tài)氮程度和對發(fā)酵參數(shù)及血液高鐵血紅蛋白的影響。試驗選取6頭湖羊，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，每期分別飼喂含0%，1%，2%，3%，4%，5%硝酸鉀的日糧。測定喂后0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0 h瘤胃液硝酸鹽和亞硝酸鹽含量及瘤胃發(fā)酵參數(shù)。晨飼后2.0 h通過頸靜脈采血，測定高鐵血紅蛋白含量。結(jié)果表明，湖羊在采食1.0 h后硝酸鹽含量達(dá)到最高（0.95～2.14 g/L），之后快速消失，亞硝酸鹽含量在喂后1.5 h達(dá)到最高（0.93～6.22μmol/L），之后降低。高鐵血紅蛋白的含量隨硝酸鹽添加量的增加而顯著升高（P＜0.01），最高達(dá)0.32%。添加硝酸鹽顯著提高瘤胃液p H值（P＜0.01）和2.0 h的氨態(tài)氮含量（P＜0.01）以及乙酸/丙酸，添加量高于3%會降低微生物蛋白和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，2%的硝酸鹽添加量微生物蛋白和總揮發(fā)性脂肪酸的合成量最高，最有利于微生物發(fā)酵。

微生物蛋白；硝酸鹽還原；瘤胃發(fā)酵；添加量

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陳志遠(yuǎn)，馬婷婷，方偉，左曉昕，林淼，趙國琦.日糧硝酸鹽水平對湖羊瘤胃硝態(tài)氮動態(tài)消失率、發(fā)酵參數(shù)及血液高鐵血紅蛋白含量的影響.草業(yè)學(xué)報，2016，25（2）：95-104.

CHEN Zhi-Yuan，MA Ting-Ting，F(xiàn)ANG Wei，ZUO Xiao-Xin，LIN Miao，ZH AO Guo-Qi.Effects of dietary nitrate dosage on ruminal nitrate disappearance rate，fermentation parameters and concentration of blood methemoglobin of Hu Sheep.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：95-104.

中國是畜產(chǎn)品生產(chǎn)大國，也是消費大國，尤其是近年來，人們對反芻動物產(chǎn)品的需求越來越大［1］。但目前，我國蛋白質(zhì)飼料自給自足率非常低，蛋白質(zhì)飼料的匱乏嚴(yán)重制約我國畜牧業(yè)的發(fā)展。非蛋白氮飼料原料作為一種良好的蛋白質(zhì)飼料替代品，能夠為瘤胃微生物蛋白的合成提供氮源。硝酸鹽作為一種非蛋白氮，制作工藝簡單，成本低廉，尤其是在低蛋白日糧情況下，其在瘤胃內(nèi)的利用效率甚至高于尿素［2］。硝酸鹽在厭氧條件下主要有3條代謝途徑：同化還原作用、異化還原作用和反硝化作用。反硝化作用產(chǎn)生N2的過程較為困難，在瘤胃內(nèi)極少存在［3-4］。同化還原和異化還原過程均為NO3-→NO2-→NH4+，但異化還原作用是硝酸鹽在瘤胃內(nèi)的主要代謝途徑［5］。硝酸鹽在被還原過程中，能夠搶奪供氫體的電子，抑制甲烷的產(chǎn)生，降低溫室氣體的排放，減少飼料能量的浪費［6］。但硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的速度要大于亞硝酸鹽還原為氨的速度，所以，若一次性大量飼喂硝酸鹽，極易造成亞硝酸鹽的積累，而亞硝酸鹽具有強烈的氧化性，通過瘤胃上皮進(jìn)入血液，將血液里的Fe2+氧化成Fe3+，使血紅蛋白失去攜帶氧的能力，從而引起高鐵血紅蛋白癥。研究表明，如果經(jīng)過一段適應(yīng)期后，反芻動物對于硝酸鹽的耐受性能夠提高3～5倍［7］。Mamvura等［8］使用芝麻油將21 mmol/L硝酸鹽包被后進(jìn)行體外試驗發(fā)現(xiàn)，包被后的硝酸鹽能大大降低亞硝酸鹽的積累，并且氨態(tài)氮的水平提高了44%，但總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著下降，另外，其包被工藝較為復(fù)雜，在實際生產(chǎn)中推廣較為困難。如何合理利用硝態(tài)氮，降低中毒風(fēng)險仍是急需解決的問題。

目前對于硝酸鹽的研究多集中在其毒性及體外產(chǎn)氣方面，并且研究結(jié)果并不一致，代俊芳等［9］采用雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的體外研究結(jié)果表明，硝態(tài)氮的添加水平對瘤胃p H值和總揮發(fā)性脂肪酸沒有顯著影響，但能提高氨態(tài)氮的水平，乙酸/丙酸隨硝態(tài)氮的提高而呈二次曲線規(guī)律變化。Lin等［10］的體外試驗表明，硝態(tài)氮并不影響總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，但會提高乙酸的濃度，降低丙酸和丁酸的濃度。Patra和Yu等［11］在培養(yǎng)底物中分別加入5和10 mmol/L的硝酸鹽，甲烷產(chǎn)量分別降低23%和43%，提高了總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸濃度，而對氨態(tài)氮的產(chǎn)量無顯著影響。由于動物瘤胃復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境及體外培養(yǎng)的條件限制，因此體外模型并不能真實反映瘤胃硝態(tài)氮的變化規(guī)律和發(fā)酵的影響。本研究以湖羊為試驗動物，通過活體試驗研究日糧硝酸鉀添加量不同對瘤胃硝酸鹽消失率和發(fā)酵參數(shù)的影響，為調(diào)控硝酸鹽的還原及優(yōu)化硝酸鹽在反芻動物日糧中的應(yīng)用提供參考資料。

1　材料與方法

1.1試驗動物及試驗設(shè)計

選取6頭9月齡，體況良好，體重相近（30±5）kg且裝有永久性瘺管的湖羊，采用隨機區(qū)組設(shè)計，試驗分為6期，以不添加硝酸鉀為對照期，每期逐量增加硝酸鉀的添加量至占日糧干物質(zhì)的1%，2%，3%，4%，5%，每個添加梯度設(shè)置14 d預(yù)試期，2 d采樣期，試驗時間為2014年4-7月。

1.2試驗日糧及飼養(yǎng)管理

參照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NRC 2007）綿羊營養(yǎng)需要配制日糧，并制粒，日糧由豆皮、燕麥草、混合精料等組成，精粗比6∶4，具體營養(yǎng)成分見表1。試驗羊每天飼喂2次（9：00和16：00），每次飼喂日糧600 g，自由飲水，保持羊舍適宜的光照和通風(fēng)，定期消毒。

1.3樣品的采集及測定指標(biāo)

采樣期分別于晨飼后0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0 h通過真空負(fù)壓裝置，從瘤胃上下左右不同點采集瘤胃液，用4層無菌紗布過濾，采用便攜式p H計立即測定p H值，然后將過濾瘤胃液分裝于6支5 m L離心管中，存放于-20℃的冰箱中，待測氨態(tài)氮、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量、微生物蛋白和揮發(fā)性脂肪酸。正試期每日晨飼后2.0 h通過頸靜脈采集5 m L血液，存入含有肝素鈉的抗凝管中，立即測定血液中高鐵血紅蛋白的含量。

表1　試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table1　Composition and nutrient levels of experimental diets（DM basis）

1.4指標(biāo)測定方法

硝酸鹽含量：參照蔡順香［12］的方法，并調(diào)整如下：吸取5 m L瘤胃液，加入5 m L飽和硼砂溶液，沸水浴10 min，并不時攪拌，冷卻，轉(zhuǎn)入250 m L容量瓶中，加2 g活性炭脫色，定容。震蕩混勻，過濾，取適量濾液，用石英比色皿在220和260 nm處比色，計算差值，同時做空白，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出硝酸鹽的含量。

亞硝酸鹽濃度：采用南京建成生物工程研究所試劑盒所述方法（比色法）進(jìn)行測定。

氨態(tài)氮濃度：采用酚-次氯酸鈉比色法［13］。

揮發(fā)性脂肪酸含量：采用日本島津GC-14B氣相色譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量［14］。瘤胃液經(jīng)12000 r/min離心20 min，取上清液1 m L，加0.2 m L 25%的偏磷酸（含60 mmol/L巴豆酸）冷凍過夜，之后再次12000 r/min離心20 min，用0.45μm濾膜過濾上清液，以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)，上樣量5μL。測定條件：毛細(xì)管柱CP-WAX（柱長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1μm）載氣為高純N2（壓力0.7 MPa，流量30 m L/min），燃?xì)釮2（流量30 m L/min），氣化室溫度200℃，F(xiàn)ID檢測器溫度200℃，柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫130℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為101，衰減為25。

高鐵血紅蛋白的測定：采用南京建成生物工程研究所高鐵血紅蛋白測定試劑盒測定。

微生物蛋白：考馬斯亮藍(lán)法測定微生物蛋白濃度［15］。

1.5統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件整理試驗數(shù)據(jù)，采用SAS 9.2軟件的PROC MIXED模型進(jìn)行方差分析，并用Tukey's法進(jìn)行差異顯著性比較。

2　結(jié)果與分析

2.1不同硝酸鹽劑量對血液高鐵血紅蛋白含量的影響

由表2可知，湖羊采食2 h后，血液高鐵血紅蛋白的含量隨著硝酸鹽添加量的增加而逐漸升高，且添加量為4%和5%時，其含量極顯著高于對照組和1%處理組（P＜0.01）。

表2　添加不同劑量硝酸鉀對湖羊血液高鐵血紅蛋白含量的影響Table2　Effects of nitrate dosages on blood methemoglobin of Hu sheep%

2.2不同硝酸鹽劑量對瘤胃液p H值的影響

由表3可知，各處理組瘤胃液p H值變化趨勢基本一致，呈先下降后上升趨勢。在采食2～4 h后達(dá)到最低點，之后逐漸回升。5%處理組的p H值均最高（6.66～6.87），且除0 h外，5%組均極顯著高于對照組、1%和2%組（P＜0.01）；0.5和2.0 h，對照組和1%～4%處理組之間無顯著差異；在1.0和1.5 h，4%處理組p H值極顯著高于對照組（P＜0.01）；對照組與1%～3%處理組之間在各個時間點差異不顯著。

2.3瘤胃液硝酸鹽濃度的動態(tài)變化

經(jīng)檢測，對照組硝酸鹽含量保持較低水平（≤0.79 g/L），并且無動態(tài)變化。各處理組硝酸鹽含量在采食后0～1 h逐漸上升，之后下降；采食0.5 h后，5%處理組硝酸鹽含量極顯著高于其他組（P＜ 0.01），其他處理組之間無顯著差異。其他時間點，各組之間無顯著差異（表4）。

2.4瘤胃液亞硝酸鹽濃度的動態(tài)變化

經(jīng)檢測，對照組亞硝酸鹽含量保持較低水平（≤0.35μmol/L），并且無動態(tài)變化。由表5可知，動物在采食后1.0～1.5 h亞硝酸鹽含量達(dá)到最高，之后迅速下降。0.5，1.0和1.5 h時，5%處理組極顯著高于其他處理組（P＜0.01），其他處理組之間無顯著差異。2 h時，5%處理組極顯著高于其他處理組，4%處理組極顯著高于1%處理組（P＜0.01）。其他時間點各組之間無顯著差異。

2.5不同硝酸鹽添加水平對氨態(tài)氮含量的影響

由表6可知，各組之間氨態(tài)氮的濃度變化基本一致，在采食后逐漸上升，1 h后達(dá)到最大值，之后逐漸下降。采食2 h后，5%處理組氨態(tài)氮濃度顯著高于1%處理組（P＜0.05），其他時間點各組之間無顯著差異。

表3　添加不同劑量硝酸鹽對湖羊瘤胃液pH值動態(tài)變化的影響Table3　Effects of nitrate dosages on dynamic change of p H value in rumen fluid

表4　湖羊瘤胃液硝酸鹽含量的動態(tài)變化Table4　Dynamic changes of nitrate concentration in rumen fluid of Hu sheep g/L

表5　湖羊瘤胃液亞硝酸鹽含量的動態(tài)變化Table5　Dynamic changes of nitrite concentration in rumen fluid of Hu sheepμmol/L

2.6不同硝酸鹽添加水平對微生物蛋白濃度的影響

由表7可知，0 h時，4%處理組微生物蛋白極顯著高于對照組（P＜0.01）。0.5，1.0，1.5，4.0，6.0，8.0 h均以2%處理組微生物蛋白濃度最高，且極顯著高于對照組（P＜0.01）。2 h的各組之間微生物蛋白濃度差異不顯著。綜合起來看，2%處理組微生物蛋白濃度最高。

表6　不同硝酸鹽添加劑量對湖羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度的影響Table6　Effects of nitrate dosages on NH3-N concentration in rumen fluid of Hu sheep mg/d L

表7　不同硝酸鹽添加劑量對湖羊瘤胃液微生物蛋白濃度的影響Table7　Effects of nitrate dosages on microbial protein concentration in rumen fluid of Hu sheep g/L

2.7不同硝酸鹽添加水平對揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表8可知，各組的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的變化趨勢基本一致，在采食后0～2 h逐漸上升，之后下降。乙酸濃度在1.5，2.0，6.0 h以2%處理組濃度最高，且極顯著高于對照組和5%處理組（P＜0.01）。1.5 h時，5%處理組乙酸濃度極顯著低于對照組（P＜0.01）。丙酸濃度在0.5，1.0，1.5，6.0 h時，2%處理組極顯著高于對照組（P＜0.01），在0.5～8.0 h之間，5%處理組丙酸濃度最低，且極顯著低于對照組（P＜0.01）。丁酸濃度在1 h時，2%，3%，4%處理組極顯著高于其他處理組（P＜0.01），2 h的5%處理組丁酸濃度極顯著低于其他處理組（P＜0.01）。6 h時，2%處理組丁酸濃度極顯著高于0%，1%，3%，5%處理組（P＜0.01）。0 h時的戊酸濃度2%處理組最高，且極顯著高于對照組（P＜0.01）。2 h時，1%和4%處理組戊酸濃度極顯著高于5%處理組（P＜0.01）。總揮發(fā)性脂肪酸在0.5～8.0 h均以2%處理組最高，并且在0.5，1.0，1.5，2.0，6.0 h極顯著高于對照組（P＜0.01）。5%處理組的總揮發(fā)性脂肪酸濃度最低。乙酸/丙酸在0.5～8.0 h均以5%處理組最高，且極顯著高于0%處理組（P＜0.01）。綜合起來看，總揮發(fā)性脂肪酸濃度2%處理組最高，乙酸/丙酸5%處理組最高。

表8　不同硝酸鹽添加量對瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table8　Effects of nitrate dosages on the concentration of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

續(xù)表8　Continued項目Items時間Time（h）e levels對照添加量Dosag SEM P CK 1%2%3%4%5%乙酸/丙酸Acetate/propionate 1.90 1.99 2.20 2.92 3.54 2.97 0.33 0.07 0.5 1.82c 1.76c 2.14bc 2.46bc 3.70a 3.27ab 0.19＜0.01 1.0 1.88bc 1.63c 1.59c 2.06bc 2.80ab 3.18a 0.20＜0.01 1.5 1.76b 1.80b 1.68b 2.38b 2.49b 3.55a 0.16＜0.01 2.0 1.32c 1.85bc 1.86bc 2.14bc 2.57ab 3.60a 0.23＜0.01 4.0 1.44b 1.76b 1.68b 1.99ab 2.22ab 3.24a 0.27＜0.01 6.0 1.36b 1.46b 1.42b 1.65b 2.43a 2.92a 0.08＜0.01 8.0 1.29c 1.37c 1.76bc 2.91ab 3.07ab 3.36a 0.24＜0.01 0

3　討論

硝酸鹽在瘤胃內(nèi)可被還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽被吸收進(jìn)入血液，將亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而使血紅蛋白失去攜氧能力，引起組織缺氧，甚至動物死亡；此外，亞硝酸鹽中毒能顯著抑制小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，降低新生細(xì)胞的存活率［16］。目前對于各種動物的中毒劑量并沒有統(tǒng)一報道。王春林等［17］研究發(fā)現(xiàn)，日糧中亞硝酸鹽含量達(dá)到900 mg/kg時，對肉鴨的健康有明顯的不良影響。Carrigan和Gardner［18］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘇丹草含硝酸鹽達(dá)3.1%時，牛出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，并繼發(fā)流產(chǎn)。Setchell和Williams［19］發(fā)現(xiàn)，山羊的中毒劑量為345 mg/ （kg BW·d）。單胃動物對硝酸鹽的耐受性較差，而反芻動物瘤胃內(nèi)微生物能將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成氨態(tài)氮從而被機體利用。因此，經(jīng)過“適應(yīng)”能提高反芻動物對硝酸鹽的耐受性［7］。當(dāng)動物血液中高鐵含量達(dá)到30%～50%時，就會導(dǎo)致組織缺氧，出現(xiàn)呼吸困難，神經(jīng)機能紊亂等癥狀［20］。本試驗中，湖羊日糧含硝酸鹽最高劑量為日糧5%，高鐵血紅蛋白含量最高達(dá)0.32%，并未出現(xiàn)明顯的中毒現(xiàn)象。由于綿羊血液內(nèi)高鐵血紅蛋白還原酶的活性較高，還原Fe3+的能力較強，所以綿羊?qū)ο跛猁}有較高的耐受性［21］。湖羊在采食硝酸鹽日糧0.5 h后，硝酸鹽濃度即以達(dá)到最大值，而亞硝酸鹽濃度1.5 h內(nèi)達(dá)到最大值，可見硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的速度是很快的，而亞硝酸鹽的積累相對滯后。林淼［22］的研究發(fā)現(xiàn)，閹肉牛在適應(yīng)2%DM的硝酸鉀后，硝態(tài)氮在1.0 h達(dá)到最高值，4.0 h后硝態(tài)氮濃度趨近于0，且不產(chǎn)生亞硝酸鹽的積累。Lewis［23］直接將25 g NaNO3和10 g NaNO2投入未經(jīng)適應(yīng)的綿羊瘤胃，發(fā)現(xiàn)在投放1.0 h后，NO3-的濃度達(dá)到最大，而NO2-的濃度則在投放4.0 h后達(dá)到最大值。Lee等［24］的研究表明，限制硝酸鹽的快速還原是降低硝酸鹽中毒風(fēng)險的重要手段。硝酸鹽的降解速率受多種因素影響。Allison和Reddy［25］發(fā)現(xiàn)動物在采食硝酸鹽3～6 d后，NO3-和NO2-的還原速率提高了3～5倍。日糧中碳水化合物在發(fā)酵過程中的某些中間產(chǎn)物可作為還原硝酸鹽的供氫體，從而影響硝酸鹽的還原。Patra和Yu［11］的研究表明，日糧中添加皂苷和硝酸鹽能夠顯著降低甲烷氣體的產(chǎn)量，且對瘤胃發(fā)酵有積極的影響。Yoshida等［26］通過體外試驗證明，高精料水平下，不利于硝酸鹽的還原。Yoshii等［27］將反芻月形單胞菌（Selenomonas ruminatium）與淀粉、淀粉分解菌共培養(yǎng)，導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累，而將S.ruminatium與纖維素、纖維分解菌共培養(yǎng)時，亞硝酸鹽的濃度顯著降低。林淼等［28］則指出，飼糧中快速發(fā)酵的碳水化合物應(yīng)維持在適當(dāng)?shù)乃剑^高或過低均不利于硝酸鹽的還原。

正常瘤胃p H值為5.5～7.5，本試驗中p H值最低5.5，最高6.87，均屬于正常范圍。婁麗平［29］研究發(fā)現(xiàn)，綿羊日糧中添加尿素、小肽、大豆蛋白作為氮源時，瘤胃液p H值并無顯著差異。代俊芳等［9］在日糧中添加占總氮的百分比為0%，6%，12%，18%，24%和30%的硝酸鉀進(jìn)行雙外流連續(xù)培養(yǎng)體外發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，日糧硝態(tài)氮水平并不影響瘤胃p H值。張建剛［30］研究表明，日糧中添加0%，0.5%，1.0%的硝酸鉀時，并未對p H值產(chǎn)生顯著影響。然而Zhou等［31］的體外實驗表明，在硝態(tài)氮添加量大于24μmol/mol時，p H值呈明顯的上升趨勢。與本試驗一致。在本試驗中，5%硝酸鹽處理組0.5～8.0 h瘤胃p H值極顯著高于其他組（P＜0.01）。高劑量的硝酸鹽能夠提高瘤胃p H值可能與氨態(tài)氮濃度的升高和揮發(fā)性脂肪酸濃度的降低有關(guān)。

瘤胃液中氨氮濃度主要取決于日糧蛋白質(zhì)水平及其降解程度、瘤胃上皮對氨氮的吸收以及日糧能量水平。本研究中，各處理組氨氮濃度在采食后呈上升趨勢，在1.5～2.0 h時達(dá)到最大，之后下降。表明日糧中的含氮物質(zhì)快速降解，超過了微生物利用氨氮的速度使氨態(tài)氮濃度升高。隨著瘤胃上皮對氨氮的吸收以及瘤胃微生物蛋白的合成，氨氮濃度逐漸下降。日糧中添加硝酸鹽均能提高氨態(tài)氮的產(chǎn)量［24，32］。從2.0 h來看，5%處理組氨氮濃度顯著大于1%處理組（P＜0.05），也是造成p H值升高的原因之一。反芻動物之所以能夠利用氨態(tài)氮，主要原因是瘤胃中的微生物能夠利用氨氮合成菌體蛋白，然后進(jìn)一步被動物機體利用。本研究中，微生物蛋白的濃度變化與氨態(tài)氮并不一致。各組均在采食后0.5 h達(dá)到最大值，微生物蛋白濃度以2%處理組最高。前人研究表明，氨態(tài)氮濃度小于5 mg/d L時，微生物能夠充分利用氨態(tài)氮合成菌體蛋白［33］。本研究中，各處理組以及各時間點均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此值，表明微生物在本試驗條件下，氨態(tài)氮不是影響微生物蛋白合成的限制因素。

日糧中的碳水化合物在瘤胃微生物的作用下降解為揮發(fā)性脂肪酸（VFA），經(jīng)瘤胃上皮吸收，是反芻動物主要的能源物質(zhì)。日糧精粗比是影響VFA的因素之一，Merchen等［34］試驗表明，日糧精粗比并不影響總VFA的濃度，但高精日糧組乙酸和丁酸濃度顯著降低，丙酸濃度顯著升高。而日糧中添加淀粉能顯著降低乙酸濃度，提高丁酸濃度［35］。本試驗中，在保持精粗比一致的前提下（6∶4）發(fā)現(xiàn)，湖羊在采食硝酸鹽1.5～2.0 h后，2%劑量組乙酸和總VFA的濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。代俊芳等［9］的體外試驗表明，日糧硝態(tài)氮水平對總揮發(fā)性脂肪酸的濃度無顯著影響，但乙酸呈先降低后上升的二次曲線關(guān)系，丙酸和丁酸則是先升高后下降，乙酸/丙酸先下降后上升。Nolan等［6］的體內(nèi)試驗表明，日糧中添加4%的KNO3對干物質(zhì)采食量、消化率以及氨氮沒有顯著影響，乙酸的摩爾比例有升高趨勢，乙酸/丙酸顯著上升。Li等［36］的研究表明，3%硝酸鹽處理組總揮發(fā)性脂肪酸低于尿素組，但乙酸及乙酸/丙酸要顯著高于尿素組。本研究中，2%處理組的乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸在大多數(shù)時間里要高于其他組，乙酸/丙酸在多數(shù)時間內(nèi)也隨硝酸鹽劑量的增加而升高，與前人研究結(jié)果一致。纖維素和半纖維素發(fā)酵過程中伴隨著氫的產(chǎn)生，硝酸鹽與氫的親和力較高，當(dāng)氫減少時，細(xì)胞中的還原型輔酶Ⅰ（NADH）就會減少，相應(yīng)的輔酶Ⅰ（NAD+）就會升高，這有利于瘤胃乙酸的產(chǎn)生［37］。亞硝酸鹽在快速還原過程中，也促使了電子從丁酸轉(zhuǎn)移到硝酸鹽還原過程中，促進(jìn)了乙酸的形成［6］。纖維在分解過程中產(chǎn)生的腺苷三磷酸（ATP）和揮發(fā)性脂肪酸可為微生物蛋白的合成提供能量和碳架。前人研究表明，添加硝酸鹽能夠降低黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的豐度［31］。這兩種菌是瘤胃內(nèi)主要的纖維分解菌［38］。本研究中，3%～5%處理組總揮發(fā)性脂肪酸濃度降低，可能是此濃度的硝酸鹽對纖維分解菌產(chǎn)生了不利影響，降低了纖維的降解率，不利于微生物蛋白的合成，同時也引起了p H值的升高。

4　結(jié)論

綜上所述，添加硝酸鹽能提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白的濃度，但過高對瘤胃發(fā)酵有不利影響。本試驗條件下，添加硝酸鹽能提高瘤胃p H值和乙酸/丙酸。采食后2.0 h能顯著提高氨態(tài)氮的濃度。硝酸鹽的濃度在采食后的1.0 h內(nèi)上升，之后下降；亞硝酸鹽的濃度在采食后1.5 h內(nèi)上升之后開始下降。2%的添加量能顯著提高微生物蛋白濃度和總揮發(fā)性脂肪酸的合成量。添加3%～5%的硝酸鹽并沒有引起湖羊中毒，但高鐵血紅蛋白含量升高，總揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白濃度降低，不利于瘤胃發(fā)酵。

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Effects of dietary nitrate dosage on ruminal nitrate disappearance rate，fermentation parameters and concentration of blood methemoglobin of Hu Sheep

CHEN Zhi-Yuan**，MA Ting-Ting**，F(xiàn)ANG Wei，ZUO Xiao-Xin，LIN Miao*，ZHAO Guo-Qi*
College of Animal Sciences and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China

This study investigated the effects of dietary nitrate dosage on ruminal nitrate disappearance rate，fermentation parameters and blood methemoglobin of Hu sheep.The experiment used a randomized block design.Six selected Hu sheep were fed different levels of dietary potassium nitrate（0%，1%，2%，3%，4%，5%of DM intake）.The concentration of nitrate，nitrite and fermentation parameters in rumen fluid were obtained 0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0 and 8.0 h after feeding.In addition，the concentration of blood methemoglobin was determined 2.0 h after feeding through blood collection from the jugular vein.The nitrate concentration increased to a maximum value（0.95-2.14 g/L）at 1.0 h after feeding，then reduced rapidly.The nitrite concentration increased to maximum value（0.93-6.22μmol/L）1.5 h after feeding.The content of methemoglobin significantly increased with the nitrate addition（P＜0.01），to a peak of 0.32%at 5%dietary potassium nitrate.Nitrate addition also significantly increased rumen fluid p H value，ammonia nitrogen concentration and acetic acid/propionic acid 2.0 h after feeding（P＜0.01）.In conclusion，potassium nitrate addi-tion at over 3%of DM intake was found to reduce the concentration of microbial protein and total volatile fatty acids.Microbial protein synthesis and total volatile fatty acids were highest with 2%potassium nitrate addition，and the dosage of 2%potassium nitrate was beneficial to rumen fermentation.

microbial protein；reducing nitrate；rumen fermentation；dosage

10.11686/cyxb2015376

2015-08-30；改回日期：2015-10-15

江蘇省博士后科研資助計劃（1402114C）和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目資助。

陳志遠(yuǎn)（1988-），男，山東德州人，在讀碩士。E-mail：czy0323@163.com。馬婷婷（1989-），女，山東濰坊人，在讀碩士。E-mail：285086492@qq.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

Corresponding author.E-mail：linmiao@yzu.edu.cn，gqzhao@yzu.edu.cn