一株抗馬鈴薯壞疽病莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）培養(yǎng)條件的優(yōu)化

馮中紅，暢　濤，楊成德，薛　莉，李　旭，楊小利（草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州730070）

一株抗馬鈴薯壞疽病莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）培養(yǎng)條件的優(yōu)化

馮中紅，暢濤，楊成德*，薛莉，李旭，楊小利
（草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州730070）

為了提高生防菌株莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）液體發(fā)酵的生物量，利用單因素試驗設計與響應曲面試驗設計相結(jié)合的方法對ZA1搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，ZA1的最佳培養(yǎng)基配比為氯化銨14.25 g、玉米粉19 g、馬鈴薯237 g、水1000 m L，最佳發(fā)酵條件為p H 7.7、培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min及發(fā)酵時間36 h，ZA1優(yōu)化后活菌數(shù)為4.12×1010CFU/m L。通過中心組合試驗設計確定ZA1在10 L發(fā)酵罐中的最佳溶氧量為60%和轉(zhuǎn)速為180 r/min；最優(yōu)條件下，發(fā)酵ZA1的放罐時間確定為36 h，活菌數(shù)達到1.59×1011CFU/ m L。該結(jié)果為利用ZA1開發(fā)生防制劑奠定了基礎。

莫海威芽孢桿菌；發(fā)酵工藝；優(yōu)化

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馮中紅，暢濤，楊成德，薛莉，李旭，楊小利.一株抗馬鈴薯壞疽病莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）培養(yǎng)條件的優(yōu)化.草業(yè)學報，2016，25（2）：77-86.

FENG Zhong-Hong，CH ANG Tao，YANG Cheng-De，XUE Li，LI Xu，YANG Xiao-Li.Optimization of culture conditions of a biocontrol agent Bacillus mojavensis ZA1 to antagonize Phoma foveata.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：77-86.

馬鈴薯壞疽?。≒homa foveata）主要危害馬鈴薯塊莖，嚴重時發(fā)病率高達50%，是馬鈴薯貯藏期主要病害［1］，被我國列為對外檢疫對象［2］，而高寒草地的珠芽蓼（Polygonum viviparum）內(nèi)生細菌莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）對其抑菌率可達71.83%，菌株發(fā)酵液在馬鈴薯儲藏期對該病原菌防效達64.31%［3］。為提高拮抗菌抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量與活菌數(shù)，很多學者對微生物發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，但微生物發(fā)酵除了受微生物生長生理及生物調(diào)控機理等因素影響外，還受到培養(yǎng)基成分、溫度、轉(zhuǎn)速、p H和溶氧量等因素的影響［4］。目前，關(guān)于拮抗菌發(fā)酵條件的優(yōu)化主要通過單因素并結(jié)合正交試驗設計或響應面試驗設計兩種方法進行研究。單因素與正交試驗分析是傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化方法，在實踐中具有簡單、直觀等特點，可以確定拮抗菌的最佳培養(yǎng)條件［5-6］，如楊尚彤等［7］利用單因素試驗和正交試驗對菌枯草芽孢桿菌JMUKC2生產(chǎn)肌苷培養(yǎng)基的碳氮源及無機鹽進行了優(yōu)化，菌體生物量比優(yōu)化前提高了40.67%，肌苷產(chǎn)量提高了46.57%；但在多因素多水平的試驗中該設計費時費力，有時還可能導致錯誤的結(jié)論［8］；Plackett-Burman試驗設計篩選出影響微生物的主要因子，再通過最陡爬坡試驗設計確定各因子的上下限，最后經(jīng)過Box-Behnken試驗設計進行響應面分析找出適合微生物生長的最佳培養(yǎng)條件［9-13］，如郭小華等［14］經(jīng)Plackett-Burman設計和最陡爬坡試驗及中心組合設計（central composite design，CCD）等設計優(yōu)化了益生芽孢桿菌（B.subtilis）MA139產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基，細菌總數(shù)從8.32×108cfu/m L提高到3.10×109cfu/m L。響應面試驗設計的分析方法具有精密度高、預測性好等優(yōu)點，該研究方法已成為目前研究發(fā)酵的常用試驗設計［15］。因此本試驗利用單因素和響應面分析結(jié)合的方法優(yōu)化了菌株ZA1的最佳培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基，以期為該菌株開發(fā)成為微生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株供試拮抗菌：ZA1，為東祁連山高寒草地珠芽蓼內(nèi)生細菌；供試病原菌：馬鈴薯壞疽病菌（Phoma foveata）。菌種均由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供。試驗于2014年進行。

1.1.2培養(yǎng)基供試培養(yǎng)基為肉汁胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g、瓊脂10 g、水1000 m L；肉汁凍培養(yǎng)液（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g、水1000 m L［16］。

1.2方法

1.2.1基礎培養(yǎng)液篩選將菌株于NA培養(yǎng)基活化24 h后，接入NB培養(yǎng)液繼續(xù)活化，得到菌落數(shù)（colonyforming units，CFU）CFU=8.55×108的發(fā)酵液，取該發(fā)酵液2 m L接入以下裝有40 m L 7種培養(yǎng)液的150 m L三角瓶中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，采用平板稀釋法測定其活菌數(shù)，3次重復，以活菌數(shù)為依據(jù)篩選基礎培養(yǎng)液。

A：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 m L。

B：馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 m L。

C（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g、水1000 m L。

D（NYDB）：牛肉膏8 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖10 g、水1000 m L。

E：玉米淀粉2.5 g、（NH4）2SO410 g、蔗糖10 g、水1000 m L。

F：玉米淀粉3.0 g、（NH4）2SO410 g、KH2PO415 g、蔗糖10 g、水1000 m L。

G（LB）：蛋白胨10 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10 g、水1000 m L。

1.2.2碳氮源篩選供試碳源：玉米淀粉，玉米粉，白砂糖，馬鈴薯淀粉，不加糖，CK：基礎培養(yǎng)基。

供試氮源：KNO3，NH4Cl，（NH4）2SO4，黃豆粉，不加氮，CK：基礎培養(yǎng)基；

將以上碳、氮源分別替換基礎培養(yǎng)液中的碳源或氮源，制得替換培養(yǎng)液，按照1.2.1的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，采用平板稀釋法測定其活菌數(shù)，3次重復，以活菌數(shù)為指標篩選最優(yōu)碳源或氮源。

1.2.3培養(yǎng)基優(yōu)化及其各因子間的交互作用根據(jù)Box-Behnken設計，對篩選得到的培養(yǎng)基各因素設3個水平，中心試驗點5次，共29個試驗點進行響應面分析。通過Design-Expert 7.0軟件進行逐步回歸方法分析，剔除交互影響小的組合，保留交互影響大的組合，并通過回歸方程擬合培養(yǎng)基各因子間及p H間的響應曲面3D圖及等高線圖，進一步明確最優(yōu)培養(yǎng)基。

1.2.4發(fā)酵溫度的優(yōu)化在最佳培養(yǎng)基的基礎上，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量為150 m L三角瓶裝40 m L，在16，20，24，28和32℃5個溫度下培養(yǎng)24 h，采用平板稀釋法測定活菌數(shù)，以活菌數(shù)為依據(jù)篩選最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.5搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化在最佳培養(yǎng)基和最佳溫度的基礎上，150 m L三角瓶裝40 m L培養(yǎng)液，在120，140，160，180和200 r/min的不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h，采用平板稀釋法測定活菌數(shù)，以活菌數(shù)為依據(jù)篩選最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.6搖床培養(yǎng)時間優(yōu)化在最佳培養(yǎng)條件下對該菌株進行培養(yǎng)，每隔6 h取樣，采用平板稀釋法測定活菌數(shù)，以活菌數(shù)為依據(jù)篩選最優(yōu)培養(yǎng)時間。

1.2.710 L發(fā)酵罐工藝的優(yōu)化以得到的最佳培養(yǎng)基、溫度及轉(zhuǎn)速的基礎上設置10 L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為160，170，180，190和200 r/min，溶氧量為20%、40%、60%、80%和100%，根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)組合設計（central composite）選取2因素通用旋轉(zhuǎn)組合，設中心試驗點為5，共13個實驗點，以搖床最優(yōu)培養(yǎng)時間為發(fā)酵時間進行響應面分析，并明確二者交互作用對菌株發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。

1.2.810 L發(fā)酵罐發(fā)酵時間的確定在最佳培養(yǎng)基、溫度、轉(zhuǎn)速和供氧量的基礎上，對菌株進行連續(xù)培養(yǎng)，每隔4 h取樣，采用平板稀釋法測定活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵時間。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert 7.0，Excel，SPSS 16.0等軟件進行試驗設計與數(shù)據(jù)處理。

圖1　不同培養(yǎng)基下的菌株濃度Fig.1　The strain concentration under different culture media

2　結(jié)果與分析

2.1基礎培養(yǎng)液的篩選

結(jié)果表明（圖1），B培養(yǎng)液中菌株活菌數(shù)為1.045×109CFU/m L，E和F培養(yǎng)液中活菌數(shù)均低于3×103CFU/m L，A，C，D，G培養(yǎng)液活菌數(shù)顯著低于B培養(yǎng)液（P＜0.01），說明B培養(yǎng)液（馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 m L）為菌株最優(yōu)培養(yǎng)基。因此，選擇B培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)液進行以下試驗。

2.2碳氮源篩選

2.2.1碳源篩選利用玉米淀粉、玉米粉、白砂糖、馬鈴薯淀粉4種碳源替換基礎培養(yǎng)液中的碳源，其中，碳源為玉米粉時培養(yǎng)液中活菌數(shù)達5.5×109CFU/m L，顯著高于其他碳源（P＜0.01）。因此，選取玉米粉為最佳碳源（圖2）。

2.2.2氮源篩選利用硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨和黃豆粉4種氮源替換基礎培養(yǎng)液中的氮源，當氯化銨為氮源時，培養(yǎng)液中活菌數(shù)為1.41×1010CFU/m L，極顯著高于其他氮源培養(yǎng)基（P＜0.01）。因此，選取氯化銨作為最佳氮源（圖3）。

2.3培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1二次回歸方程的建立通過培養(yǎng)基及碳氮源篩選，確定基礎培養(yǎng)液的主要成分為氯化銨、玉米粉和馬鈴薯，p H為7，對各因子取不同水平的值（表1）。根據(jù)響應曲面法（Box-Behnken）設計，試驗設計與結(jié)果見表2，利用Design-Expert 7.0軟件進行二次多項回歸擬合，得出菌株活菌數(shù)對氯化銨、玉米粉、馬鈴薯及p H的動態(tài)響應模型：

式中，Y為此菌活菌數(shù)的預測值，R2=0.9714，矯正決定系數(shù)Adj-R2=0.9273。校正決定系數(shù)表明回歸模型擬合程度較好；氯化銨、玉米粉、馬鈴薯及p H對活菌數(shù)的影響顯著，該模型（P＞F）P＜0.0001，表明回歸方程的擬合度極顯著，矢擬項（P＞F）P=0.196，表明該模型在實際擬合中所占的非正常誤差較小。因此，可通過回歸模型預測該菌株的最佳培養(yǎng)條件。該模型預測氯化銨、玉米粉和馬鈴薯的最佳添加量分別為14.25 g/L，19 g/L和237 g/L，培養(yǎng)液p H為7.74時，此菌的活菌數(shù)有最大值3.27×1010CFU/m L；經(jīng)驗證，在該培養(yǎng)條件下的活菌數(shù)可達3.48×1010CFU/m L，與預測值差異不顯著。說明此菌的最佳培養(yǎng)液配方為氯化銨14.25 g/L、玉米粉19 g/L、馬鈴薯237 g/L和p H 7.7。

圖2　不同碳源下的菌株濃度Fig.2　The strain concentration under different carbon sources

圖3　不同氮源下的菌株濃度Fig.3　The strain concentration under different nitrogen source

2.3.2因子間的交互作用利用SPSS 16.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合處理，得到各因子間交互作用的相應曲面和等高線圖（圖4～圖8）。圖中X1：氯化銨，X2：玉米粉，X3：馬鈴薯，X4：p H；當變量X3、X4取值為0時，圖4表明X1、X2間的交互作用，當X1取值范圍在0.5～1.0，X2的取值范圍在0～0.5時，具有最高點，說明此時二者交互作用最大；當變量X2、X4取值為0時，圖5表明X1、X3間的交互作用，當X1取值范圍在0.5～1.0，X3的取值范圍在0.5～1.0時，具有最高點，說明此時二者交互作用最大；當變量X2、X3取值為0時，圖6表明X1、X4間的交互作用，當X1與X3取值范圍均在0.5～1.0時，具有最高點，說明此時二者交互作用最大；當變量X1、X3取值為0時，圖7表明X2、X4間的交互作用，當X2取值范圍在0.5～1.0，X3的取值范圍在-1.0～-0.5時，具有最高點，說明此時二者作用較大；當變量X1、X2取值為0時，圖8表明X3、X4間的交互作用，當X1與X3取值范圍均在0～0.5時，具有最高點，說明此時二者交互作用最大。因此，在最高點處，即兩因素交互作用最大時，說明該條件下此菌株的發(fā)酵能達到較穩(wěn)定水平。

2.3.3發(fā)酵溫度的優(yōu)化在最佳培養(yǎng)液的基礎上，隨著溫度的增加，活菌數(shù)亦逐漸增加，至28℃時，活菌數(shù)達到最大，為3.48×1010CFU/m L，極顯著高于其他溫度下的活菌數(shù)（P＜0.01），32℃時，活菌數(shù)開始下降，表明此菌的最佳培養(yǎng)溫度為28℃（圖9）。

表1　響應曲面設計試驗各因子取值范圍Table1　The value range of factors for box-behnken design

表2　響應曲面設計和試驗結(jié)果Table2　Experimental design and results of box-behnken design

圖4　氯化銨（X1）和玉米粉（X2）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.4　Response surface of the NH4Cl（X1）and corn flour（X2）interactions on ZA1 strain concentration

圖5　氯化銨（X1）和馬鈴薯（X3）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.5　Response surface of the NH4Cl（X1）and potato（X3）interactions on ZA1 strain concentration

圖6　氯化銨（X1）和p H（X4）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.6　Response surface of the NH4Cl（X1）and p H（X4）interactions on ZA1 strain concentration

圖7　玉米粉（X2）和p H（X4）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.7　Response sur face of the corn flour（X2）and p H（X4）interactions on ZA1 strain concentration

圖8　馬鈴薯（X3）和pH（X4）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.8　Response surface of the potato（X3）and pH（X4）interactions on ZA1 strain concentration

圖9　不同培養(yǎng)溫度下的菌株濃度Fig.9　The strain concentration under different culture temperature

圖10　不同搖床轉(zhuǎn)速下的菌株濃度Fig.10　The strain concentration under different rotate speed

圖11　不同培養(yǎng)時間下的菌株濃度Fig.11　The strain concentration under different culture time

2.3.4搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果表明，在最佳培養(yǎng)液和溫度的基礎上，隨著轉(zhuǎn)速的增大，活菌數(shù)也依次增大，180 r/min時活菌數(shù)達到最大值3.64×1010CFU/ m L，顯著高于其他轉(zhuǎn)速條件下的活菌數(shù)（P＜0.05），超過200 r/min時，活菌數(shù)開始下降，說明該菌株的最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速是180 r/min（圖10）。

2.3.5最佳搖瓶發(fā)酵時間優(yōu)化結(jié)果表明（圖11），在28℃、180 r/min及最佳培養(yǎng)液的基礎上，搖瓶發(fā)酵初始階段，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液活菌數(shù)快速增加，培養(yǎng)至36 h時活菌數(shù)達到最大值4.12×1010CFU/m L，之后各時間段活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05），保持平穩(wěn)，因此，搖瓶發(fā)酵的最佳時間是36 h。

2.410 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.4.1二次回歸方程的建立通過10 L發(fā)酵罐優(yōu)化溶氧量及轉(zhuǎn)速，對這兩個因子取不同水平的值（表3），根據(jù)中心組合設計，試驗設計與結(jié)果見表4，利用Design-Expert 7.0軟件進行二次多項回歸擬合，得出菌株活菌數(shù)對溶氧量及轉(zhuǎn)速的動態(tài)響應模型：式中，Y為該菌株活菌數(shù)的預測值，校正決定系數(shù)表明回歸模型擬合程度較好，表明溶氧量與發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速對活菌數(shù)的影響顯著；該模型（P＞F）P＜0.0001，表明回歸方程的擬合度極顯著；矢擬項（P＞F）P=0.8733，表明該模型在實際擬合中所占的非正常誤差較?。灰虼?，可通過回歸模型預測菌株在發(fā)酵罐中的最佳培養(yǎng)條件。該模型預測當溶氧量為60%，轉(zhuǎn)速為181.3 r/min時，活菌數(shù)有最大值1.52×1011CFU/m L；與轉(zhuǎn)速為180 r/min、最佳溶氧量為60%時的實際值1.51×1011CFU/m L差異不顯著（P＞0.05）。因此，確定轉(zhuǎn)速為180 r/min，最佳溶氧量為60%作為菌株在10 L發(fā)酵罐中的最佳培養(yǎng)條件。

表3　中心組合設計試驗各因子取值范圍Table3　The value range of factors for central composite design（CCD）

表4　中心組合設計和試驗結(jié)果Table4　Experimental design and results of central composite design（CCD）

2.4.2溶氧量與轉(zhuǎn)速的交互作用圖12表明，當A與B取值范圍均在0～0.5時，具有最高點，說明此時二者交互作用最大，對菌株發(fā)酵液中活菌數(shù)有顯著影響。

圖12　溶氧量（A）和轉(zhuǎn)速（B）交互作用對ZA1菌株濃度影響的響應曲面圖Fig.12　Response surface of the dissolved oxygen（A）and speed（B）interactions on ZA1 strain concentration

2.510 L發(fā)酵罐發(fā)酵時間優(yōu)化

圖13表明，在28℃、180 r/min、溶氧量60%及最佳培養(yǎng)液的基礎上，菌株發(fā)酵初始階段，隨著時間的推移發(fā)酵液生物量迅速增加，12 h后增長速率變小，至36 h活菌數(shù)達到最大值1.59×1011CFU/m L，并進入平穩(wěn)期，說明發(fā)酵罐發(fā)酵最佳時間為36 h。

綜上所述，菌株ZA1的最優(yōu)發(fā)酵條件為：p H 7.7、培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、溶氧量60%、培養(yǎng)基成分為氯化銨14.25 g/L、玉米粉19 g/L、馬鈴薯237 g/L、發(fā)酵36 h，活菌數(shù)可達到1.59×1011CFU/m L。

圖13　不同培養(yǎng)時間下的菌株濃度Fig.13　The strain concentration under different culture time

3　討論

前期研究表明［3］，從東祁連山高寒草地珠芽蓼體內(nèi)分離得到的內(nèi)生菌ZA1對馬鈴薯壞疽病菌等貯藏期病原菌具有明顯的抑制作用，且抑菌譜廣。為了提高其產(chǎn)抑菌物質(zhì)的濃度，本試驗結(jié)合單因素試驗設計與響應面設計法對該菌株的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，關(guān)于生防菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，國內(nèi)外已有大量報道［17-19］，但關(guān)于莫海威芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究鮮見報道。在優(yōu)化試驗中，正交試驗設計或響應面試驗設計是常用的方法，由于正交試驗設計周期長，試驗次數(shù)多，較繁瑣，而作為數(shù)學與統(tǒng)計學相結(jié)合的響應面分析法成為目前常用的綜合工程優(yōu)化方法［20-23］，該方法能確定多種因子間的交互作用，并能通過擬合多元回歸方程精確預測優(yōu)化值，已被廣泛應用于微生物發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域。如葉云峰等［24］通過正交試驗設計和單因素試驗法對枯草芽孢桿菌B47產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使菌株產(chǎn)生的抗菌活性顯著提高；文才藝等［25］也通過相同的方法對樟樹內(nèi)生細菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化；侯敏等［26］用單因素和正交試驗法優(yōu)化了番茄枯萎病拮抗菌株S13產(chǎn)芽孢的搖瓶發(fā)酵條件。本研究通過單因素試驗與響應面試驗相結(jié)合確定該菌最適培養(yǎng)基成分為氯化銨14.25 g/L、玉米粉19 g/L、馬鈴薯237 g/L，p H 7.7。以最優(yōu)培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)液，通過單因素試驗優(yōu)化搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間等主要因素，在此基礎上，通過10 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化，此菌株最佳溶氧量及轉(zhuǎn)速分別為60%，180 r/min時，其發(fā)酵液活菌數(shù)達1.59×1011CFU/m L。車曉曦等［27］利用響應曲面法將解淀粉芽孢桿菌CAB-1的發(fā)酵產(chǎn)量從優(yōu)化前的2.28×109CFU/m L提高到了3.0×109CFU/m L；李浩等［28］利用響應面法優(yōu)化生防菌吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007的發(fā)酵工藝，使得優(yōu)化效率比優(yōu)化前提高了1.35倍；高嬋娟等［29］通過響應面法對黑蓋木層孔菌菌絲體產(chǎn)量進行優(yōu)化，結(jié)果證明優(yōu)化前的模型預測值與優(yōu)化后驗證值差異不顯著。綜上所述，該試驗結(jié)果可為該菌開發(fā)為生物源農(nóng)藥或菌肥提供可靠的理論依據(jù)及技術(shù)支撐。

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Optimization of culture conditions of a biocontrol agent Bacillus mojavensis ZA1 to antagonize Phoma foveata

FENG Zhong-Hong，CHANG Tao，YANG Cheng-De*，XUE Li，LI Xu，YANG Xiao-Li
Key Laboratory of Grassland Ecosystem Gansu Agricultural University，Ministry of Education，College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University，Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province，Sino-U.S.Center for Grazingland Ecosystem Sustainability，Lanzhou 730070，China

This work aimed to identify optimum fermentation shaker-flask culture conditions for Bacillus mojavensis strain ZA1.Various single culture factors were combined according to a Box-Behnken design.The optimum ratio of ingredients for the culture medium for ZA1was found to be：14.25 g ammonium chloride，19 g corn flour，and 237 g potato，in 1000 m L distilled water.The optimum cultivation conditions were p H 7.7，temperature 28℃，and shaken at 180 r/min for 36 h.Under these conditions，the viable count of B.mojavensis strain ZA1 was 4.12×1010colony-forming units per m L（CFU/m L）.Further testing using the central composite design method in a 10 L fermentation tank found the optimum for dissolved oxygen level and shaker rotation speed to be 60%saturation and 180 r/min respectively.Under these conditions，when fermentation time was 36 h in the fermentation tank，the viable count of B.mojavensis strain ZA1 reached 1.59×1011CFU/m L. The results of this study lay a solid foundation for the development of methodology for large scale production of biocontrol agents.

Bacillus mojavensis；fermentation process；optimization

10.11686/cyxb2015142

2015-03-17；改回日期：2015-05-15

國家自然科學基金（No.31160122）資助。

馮中紅（1991-），女，甘肅臨夏人，在讀碩士。E-mail：1142595813@qq.com

Corresponding author.E-mail：yangcd@gsau.edu.cn