實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在手足口病病原體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用

趙凱麗，王　芳，林　牧，龔亞?wèn)|（貴州航天醫(yī)院兒科，貴州遵義563000）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在手足口病病原體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用

趙凱麗，王芳，林牧，龔亞?wèn)|△（貴州航天醫(yī)院兒科，貴州遵義563000）

目的探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)在手足口病（HFMD）病原體檢測(cè)中的應(yīng)用，了解遵義市HFMD流行特征。方法收集2015年5～7月該院兒科初步診斷為HFMD的85例患兒的咽拭子、皰疹液標(biāo)本，采用FQPCR檢測(cè)標(biāo)本中腸道通用型病毒（EV-U）、腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A組16型（CoxA16），同時(shí)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果85例HFMD患兒采用FQ-PCR法檢出65例EV-U陽(yáng)性，陽(yáng)性率為76.5%，其中2歲以下年齡段患兒陽(yáng)性40例，陽(yáng)性率為80.0%（40/50），2～5歲患兒陽(yáng)性25例，陽(yáng)性率為71.4%（25/35）。ELISA法檢測(cè)EV-U陽(yáng)性52例，其中2歲以下年齡段患兒陽(yáng)性31例，陽(yáng)性率為62.0%（31/50），2～5歲年齡段患兒陽(yáng)性21例，陽(yáng)性率為60.0%（21/35）。2種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論FQ-PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、速率快等特點(diǎn)更適用于臨床檢測(cè)HFMD病原體。2015年遵義市HFMD病原體以EV71較多，其次是CoxA16。

手足口??；腸道病毒屬；傳染病控制；感染；聚合酶鏈反應(yīng)

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的一種急性傳染病，其具有較強(qiáng)的流行能力、傳染性及復(fù)雜的傳播媒介方式等特點(diǎn)，多發(fā)于學(xué)齡前兒童，尤以5歲以下年齡段發(fā)病率最高，是危害兒童健康的主要疾病。HFMD典型的臨床表現(xiàn)為手、足、口腔等部位出現(xiàn)不同程度的皮膚黏膜皮疹、皰疹、潰瘍，甚至可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜炎等嚴(yán)重并發(fā)癥［1］，尤以重癥患兒病情發(fā)展快，易危及生命。有20多種（型）可引起HFMD的腸道病毒，其中以腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）最為常見(jiàn)［2］，盡管這2種病毒的遺傳背景差異不大，但EV71感染引起重癥病例的概率較高。雖然多種腸道病毒均可引起HFMD，但不同類型的病毒引起的疾病過(guò)程也有很大差異。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢查一般采用病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法來(lái)確診HFMD病原體，病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，需要4～15 d，而常用的腸道病毒組合血清并不能包括D血清型，如CoxA16和EV71等，且對(duì)技術(shù)要求過(guò)于苛刻，很難保證在暴發(fā)疫情時(shí)及時(shí)確診。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）是一種利用PCR法對(duì)核酸快速高效擴(kuò)增的技術(shù)，具有操作方便、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，本文采用FQPCR技術(shù)對(duì)貴州航天醫(yī)院兒科住院的2～5歲初步診斷為HFMD的患兒進(jìn)行病原體檢測(cè)，以評(píng)估該檢測(cè)方法在HFMD病原體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料參照第7版《實(shí)用兒科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2015年5～7月本院兒科初步診斷為HFMD的85例患兒作為研究對(duì)象。85例患兒中男45例，女40例；年齡7個(gè)月至5歲，其中2歲以下50例，2～5歲35例。在征得家長(zhǎng)同意的情況下，分別采集入選患兒咽拭子標(biāo)本85份，皰疹液標(biāo)本25份。標(biāo)本采集使用無(wú)菌拭子，采集完畢后立即將標(biāo)本置于病毒保養(yǎng)液中，并于-20℃保存。

1.2儀器與試劑PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀采用美國(guó)Applied Biosystems real time 7500（ABI 7500）；HFMD病原體檢測(cè)試劑有HERQ020124-3B EV71、CA16及通用型腸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒，均由江蘇默樂(lè)生物科技有限公司提供，均通過(guò)國(guó)家食品藥品管理局（FDA）認(rèn)證并注冊(cè)批準(zhǔn)生產(chǎn)應(yīng)用于臨床檢測(cè)。診斷標(biāo)準(zhǔn)以該類相關(guān)試劑盒的核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果為準(zhǔn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）所用EV71 IgG及CoxA16 IgG檢測(cè)試劑由北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法FQ-PCR法取原始樣本200 μL，采用固相提取法中的柱式提取法提取RNA，并用PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀ABI 7500進(jìn)行擴(kuò)增，按照相關(guān)試劑說(shuō)明書進(jìn)行溫度條件及循環(huán)擴(kuò)增參數(shù)配置，同時(shí)設(shè)置不同濃度梯度定量品及陰性、陽(yáng)性對(duì)照。嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行ELISA操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.12種方法檢測(cè)結(jié)果比較采用FQ-PCR法檢測(cè)85例初步診斷為HFMD患兒的咽拭子標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，腸道通用型病毒（EV-U）陽(yáng)性 65例，陽(yáng)性率 76.5%（65/85）；其中2歲以下年齡段患兒陽(yáng)性40例，陽(yáng)性率為80.0%（40/50），2～5歲年齡段患兒陽(yáng)性25例，陽(yáng)性率為71.4%（25/35）；2歲以下年齡段患兒EV-U陽(yáng)性率高于2～5歲年齡段患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EV-U陽(yáng)性的65例患兒中EV71陽(yáng)性40例，陽(yáng)性率為61.5%（40/65），CoxA16陽(yáng)性25例，陽(yáng)性率為38.5%（25/65）。在不同類型樣本的檢測(cè)比較中，咽拭子樣本陽(yáng)性率為60.0%（51/85），皰疹樣本陽(yáng)性率為72.0%（18/25）。ELISA檢測(cè)EV-U陽(yáng)性52例，其中2歲以下年齡段患兒陽(yáng)性31例，陽(yáng)性率為62.0%（31/50），2～5歲年齡段患兒陽(yáng)性21例，陽(yáng)性率為60.0%（21/35）；其中EV71陽(yáng)性20例，陽(yáng)性率為38.5% （20/52），CoxA16陽(yáng)性12例，陽(yáng)性率為23.1%（12/52）。FQ-PCR法檢測(cè)EV-U的陽(yáng)性率高于ELISA法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2FQ-PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線處（除未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的陰性對(duì)照曲線外）大致分為3種形態(tài)：（1）循環(huán)閾值（Ct值）從12個(gè)循環(huán)開(kāi)始上揚(yáng)的曲線，形狀呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，說(shuō)明該樣本中含有的RNA病毒拷貝數(shù)很高；（2）Ct值從22～26個(gè)循環(huán)開(kāi)始呈上揚(yáng)的曲線，形狀基本呈“S”形，說(shuō)明該樣本中含有的RNA病毒拷貝數(shù)較高；（3）Ct值從30個(gè)循環(huán)開(kāi)始呈上揚(yáng)的曲線，形狀暫無(wú)法看出呈“S”形，但若再經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)循環(huán)后便會(huì)呈現(xiàn)“S”形曲線，說(shuō)明該樣本中含有一定拷貝數(shù)的RNA病毒，可診斷為HFMD陽(yáng)性。見(jiàn)圖1。

圖1　Taq酶探針FQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3　討　論

多種人腸道病毒引起的HFMD是一種全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害兒童健康的傳染病，柯薩奇病毒是被新西蘭最早發(fā)現(xiàn)的HFMD病毒，Robinson和Rhodes 2位加拿大學(xué)者在1958年首次從患者中分離出柯薩奇病毒［3］，1972年EV71也被美國(guó)發(fā)現(xiàn)屬于HFMD病毒［4］。傳播速度快、較強(qiáng)的流行能力和傳染性及復(fù)雜的傳播方式能在較短的時(shí)間內(nèi)大規(guī)模流行，可通過(guò)消化道和呼吸道進(jìn)行傳染［5］，一旦流行疫情難以控制。我國(guó)原衛(wèi)生部在2008年5月2日將HFMD列入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的丙類傳染病。該病病原體為腸道病毒，主要是EV71及CoxA16。EV71感染患兒常伴嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，且EV71感染的危害性最大，致死率最高。自限性HFMD多因CoxA16感染所引起，一般預(yù)后較好，發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥和死亡的概率極低［6］。

目前，HFMD病原體檢測(cè)一般采用病毒培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和FQ-PCR檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)等技術(shù)，其傳統(tǒng)的診斷以臨床表現(xiàn)為主要手段，早期檢測(cè)常為陰性。RT-PCR多次擴(kuò)增的檢測(cè)方式易出現(xiàn)假陽(yáng)性，交叉污染等存在操作繁瑣易污染等缺點(diǎn)，且對(duì)檢測(cè)CoxA16的靈敏度不夠高［7］。本研究選取85例本院兒科初步診斷為HFMD的患兒為研究對(duì)象，采用FQ-PCR技術(shù)對(duì)患兒85份咽拭子標(biāo)本和25份皰疹液標(biāo)本進(jìn)行EV71及CoxA16檢測(cè)，結(jié)果顯示，EV-U檢出陽(yáng)性率為76.5%，具有較好的檢測(cè)靈敏度，這可能與不同類型的標(biāo)本有關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)Q-PCR較ELISA法的檢測(cè)靈敏度更高。陽(yáng)性樣本患兒發(fā)病7d內(nèi)的傳染能力最強(qiáng)，7～14 d從咽部可檢測(cè)到病毒，21～35 d從糞便中可檢測(cè)到病毒，一般皰疹液中存有大量病毒，其中一些治愈的患兒在其排出的糞便中檢測(cè)出病毒的生存周期可達(dá)數(shù)月［9］。

本研究檢測(cè)為EV-U陽(yáng)性的65例患兒中，EV71感染陽(yáng)性40例，CoxA16陽(yáng)性25例，說(shuō)明在貴州省遵義地區(qū)HFMD的發(fā)病以EV71感染為主，這與文獻(xiàn)報(bào)道的貴州省流行病學(xué)特征相符合［10］。本研究中皰疹液標(biāo)本陽(yáng)性率為72.0%（18/25）高于咽拭子的60.0% （51/85），但因咽拭子采集操作步驟簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷、不抽血等特點(diǎn)，患兒及家長(zhǎng)均較易于接受，所以實(shí)驗(yàn)室推薦采用咽拭子標(biāo)本采集法。

通過(guò)對(duì)EV71、CoxA16感染病例的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，EV71與CoxA16引起的HFMD在臨床表現(xiàn)等方面差異不大，但EV71易致腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫，可能危及生命。因此，采用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行HFMD病原體檢測(cè)顯得尤為重要，其具有不易污染、特異性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠在HFMD疫情暴發(fā)和臨床患兒感染的早期做出高通量、快速診斷。此外，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在HFMD病原體潛伏期即能區(qū)分是否感染，對(duì)于HFMD的及時(shí)監(jiān)測(cè)和防控具有重要作用。

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Clinical application of real-time fluorescence quantification PCR technology in HFMD pathogen detection

Zhao Kaili，Wang Fang，Lin Mu，Gong Yadong△（Department of Pediatrics，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo investigate the application of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）technology in hand-foot and mouth disease（HFMD）pathogens detection，and to understand the HFMD epidemic characteristics in Zunyi City.MethodsThe throat swabs and herpes liquid samples were collected from 85 children patients with preliminarily diagnosed HFMD in the pediatric department of our hospital.EV-U，EV71 and coxsackievirus A 16（CoxA16）were detected by using the FQ-PCR technology，meanwhile the obtained results were compared with those detected by ELISA.Results

Among 85 cases of HFMD，65 cases of EV-U positive were detected by FQ-PCR，the positive rate was 76.5%，in which 40 cases were in the age group of less than 2 years old，the positive rate was 80.0%（40/50），25 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 71.4%（25/35）.Fifty-two cases of EV-U positive were detected by ELISA，in which 31 cases were the age group of under 2 years old，the positive rate was 62.0%（31/50），21 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 60.0%（21/35），the difference between these two kinds of method was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe FQ-PCR technology of HFMD pathogen detection is more suitable for the clinical application due to the characteristics of high sensitivity，strong specificity and high speed.The HFMD pathogens in Zunyi City during 2015 are mainly EV71，followed by CoxA 16.

Hand，foot and mouth disease；Enterovirus；Communicable disease control；Infection；Polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.15.012

A

1009-5519（2016）15-2310-02

趙凱麗（1973-），副主任醫(yī)師，主要從事兒科臨床工作。

△，E-mail：747755680@qq.com。

（2016-03-24）