葡萄糖氧化酶在修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)*

耿方勇,李　迪,張鈺帥,楊曉璐,肖寶林,洪　軍

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南　開封　475000)

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葡萄糖氧化酶在修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)*

耿方勇,李迪,張鈺帥,楊曉璐,肖寶林,洪軍

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封475000)

將葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)固定在由多壁碳納米管(MWCNTS)和石墨烯(Graphene)構(gòu)成的納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極上，最外層用殼聚糖(Chitosan)進(jìn)行覆蓋，利用循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)來測量葡萄糖氧化酶在修飾電極上的電化學(xué)和電催化反應(yīng)，測得電子傳遞速率常數(shù)ks為0.87 s-1，電活性物質(zhì)表面密度Г為1.54×10-10mol/cm-2,動力學(xué)表觀米氏常數(shù)Km為1.32×103μmol/L,線性檢測范圍為：40～1000 μmol/L，修飾電極有較好的穩(wěn)定性，而且修飾電極在檢測底物時有較好的抗干擾能力，因此，該體系修飾的電極有希望構(gòu)建第三代葡萄糖生物傳感器。

石墨烯；多壁碳納米管；直接電化學(xué)；穩(wěn)定性；抗干擾

葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性、高活性、催化高效性、對人體無毒副作用等優(yōu)點被廣泛地應(yīng)用于許多方面，如在食品工業(yè)，可用于去葡萄糖、脫氫、殺菌；在飼料添加方面，是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境[1]。同時，在生物方面，用來構(gòu)建生物傳感器是最具有商業(yè)價值的。

增加氧化還原蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)速率是開發(fā)生物傳感器、生物燃料電池的先決條件。然而,蛋白質(zhì)活性中心與電極表面進(jìn)行直接電子通信是困難的, 正如葡萄糖氧化酶，其起到傳遞電子作用的活性中心FAD是深深嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[2-3]。因此通過各種方法使兩者之間能夠進(jìn)行電子通信是首要問題。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料的應(yīng)用已滲透到傳感器的設(shè)計中，石墨烯具有極大的比表面積和良好的電子傳遞性能，并有很好的生物相容性，在酶的直接電化學(xué)、生物小分子的電化學(xué)檢測中都具有極其優(yōu)異的性能[4]。多壁碳納米管具有較大比表面積、化學(xué)穩(wěn)定性好、生物兼容性好、具有良好的電子傳遞能力，被廣泛的應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域中[5]。

由于石墨烯為單層的片狀結(jié)構(gòu)，多壁碳納米管為管狀結(jié)構(gòu)，綜合二者優(yōu)點制作復(fù)合材料，將管狀的多壁碳納米管復(fù)合在單層片狀結(jié)構(gòu)的石墨烯上，從而增大酶的附著量，并提高酶的活性中心與電極之間的電子傳遞速率。

本文將從葡萄糖氧化酶固定于修飾有納米高分子復(fù)合材料的玻碳電極表面，通過循環(huán)伏安測試法研究酶在電極上的電化學(xué)行為及電化學(xué)特性，實現(xiàn)了直接電化學(xué)研究。

1　實　驗

1.1儀器

KQ-100B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； CHI650C電化學(xué)分析儀，上海辰華儀器公司； PHS-3C型精密酸度計，上海大普儀器公司；CP214型電子天平，河南中良科學(xué)儀器有限公司。

1.2試劑

葡萄糖氧化酶、多壁碳納米管、石墨烯、殼聚糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖(Glucose, Glu)，均購于Sigma公司；其它試劑均為分析純，所有溶液均用去離子雙蒸水配置。

2　結(jié)果與討論

2.1不同修飾材料循環(huán)伏安曲線對比

圖1　不同修飾材料循環(huán)伏安曲線對比圖

在50 mmol/L PBS溶液緩沖液(pH 7)中，采用CV法對修飾電極的電化學(xué)行為進(jìn)行研究，掃描速率為0.05 V/s。圖1顯示了不同修飾電極的循環(huán)伏安圖：曲線a、b均為無明顯氧化還原峰，而曲線c在-0.1～ -0.3之間具有一對明顯的氧化還原峰，實驗結(jié)果表明GOD在納米復(fù)合材料修飾的玻碳電極上具有電化學(xué)活性，是一準(zhǔn)可逆的電子傳遞氧化還原反應(yīng)過程[6-7]。

2.2循環(huán)伏安法測量GOD電化學(xué)反應(yīng)機(jī)制

圖2　不同掃描速度CV曲線圖(A)，不同掃描速度GOD峰電流值與掃描速度圖(B)和GOD峰值電壓與掃描速度對數(shù)圖(C)

圖2(A)顯示了在50 mmol/L PBS溶液緩沖液(pH 7)中，不同掃描速率下修飾電極CV曲線圖。

圖2(B)顯示在掃描速率為0.01～0.4 V/s范圍內(nèi)，陰極峰電流和陽極峰電流二者與電壓成線性關(guān)系，這說明了GOD與電極之間的電子傳遞過程是固化機(jī)制[8]。

峰值電壓與掃描速度自然對數(shù)的線性關(guān)系如圖2(C)所示，修飾電極在掃描速率0.2～0.4 V/s的范圍內(nèi)，陰極峰電壓變化(Epc)與lnv成線性關(guān)系為。

根據(jù)Laviron公式：

(1)

式中：α——陰離子遷移系數(shù)

n——電子數(shù)

R——氣體常數(shù)，R=8.314 J·mol-1·K-1

F——法拉第常數(shù)，F(xiàn)=96493 C/mol

T——溫度，T=298 K

根據(jù)公式(1)計算得α·n=1.15 (0.3<α<0.7)，n=2, 說明了GOD與電極之間的氧化還原反應(yīng)是雙電子傳遞過程。

(2)

根據(jù)公式(2)可以計算出電子遷移速率常數(shù)(ks)[9-10],由圖C中兩條趨勢線交點可以計算出lnv=-2.754；ks=0.87 s-1。

再根據(jù)公式

(3)

式中：A——電極表面積

Γ——電活性物質(zhì)表面密度

得出表面密度Γ為1.54×10-10mol/cm2，和PDB單層理論值1.7×10-10mol/cm2十分接近，因此酶在修飾電極上是單層分布的，這主要是由于納米復(fù)合材料具有較大的比表面積，能夠使酶穩(wěn)定的附著在其表面。

2.3對葡萄糖的檢測

圖3　峰值電流隨底物濃度變化圖(插圖為GOD ineweaver-Burk圖)

圖3為全修飾電極在Glu存在時峰值電流與Glu濃度關(guān)系圖，從圖3中可以得出修飾體系的線性檢測范圍為40～1000 μmol/L。

圖3中插圖表示的是對于固定化的GOD，催化電流與底物濃度之間的關(guān)系遵循米氏動力學(xué)機(jī)制：

3　Chi/MWCNTs/Graphene/GOD/GC電極抗干擾實驗

對全修飾的電極進(jìn)行抗干擾實驗，如圖4所示，先后加入葡萄糖溶液，電流均有較明顯的下降，待電流穩(wěn)定后加入維生素B1，電流并未有所改變，再加入葡萄糖溶液后，電流又有明顯下降，接著加入抗壞血酸和尿酸后均未產(chǎn)生電流變化，最后再次加入葡萄糖溶液，電流再次降低，因此，構(gòu)建的電極體系具有很高的選擇性，抗干擾能力強(qiáng)。

圖4　電流-時間曲線

此外研究修飾電極的穩(wěn)定性，將電極在反應(yīng)池中浸泡0.5 h后采用CV法進(jìn)行多次掃描，曲線幾乎重合；將初始電極放置一天一夜后測量其信號強(qiáng)度，達(dá)到初始信號強(qiáng)度的96.7%，因此本實驗構(gòu)建的全修飾電極有較好的穩(wěn)定性。

4　結(jié)　論

葡萄糖氧化酶在石墨烯-多壁碳納米管復(fù)合材料修飾的電極上可實現(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)行直接電化學(xué)，修飾電極對葡萄糖具有生物催化活性，檢測范圍為40～1000 μmol/L，構(gòu)建的體系具有較高的選擇性，抗干擾能力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，因此該體系有希望用于檢測葡萄糖濃度，構(gòu)建第三代生物傳感器。

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Direct Electrochemistry of Glucose Oxidase on A Nano Complex Modified Glassy Carbon Electrode*

GENGFang-yong,LIDi,ZHANGYu-shuai,YANGXiao-lu,XIAOBao-lin,HONGJun

(School of Life Sciences, Henan University, Henan Kaifeng 475000, China)

graphene; multi-walled carbon nanotubes; direct electrochemistry; stability； anti-interference

河南大學(xué)特聘教授科研啟動基金(No：5443D0810)。

耿方勇(1994-)，男，河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生。

洪軍，博士，校特聘教授，碩士生導(dǎo)師。

O646

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1001-9677(2016)07-0122-03