微核技術在廣西宜州城區(qū)水質(zhì)監(jiān)測中的應用研究

賀慶梅， 王旭彤， 謝彥軍， 黃承瀟， 楊曉清， 李世標

(1.河池學院　化學與生物工程學院， 廣西　宜州　546300； 2.蘭州市第五十四中學， 甘肅　蘭州　730030)

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微核技術在廣西宜州城區(qū)水質(zhì)監(jiān)測中的應用研究

賀慶梅1， 王旭彤2， 謝彥軍1， 黃承瀟1， 楊曉清1， 李世標1

(1.河池學院化學與生物工程學院， 廣西宜州546300； 2.蘭州市第五十四中學， 甘肅蘭州730030)

通過蠶豆根尖微核技術，對宜州城區(qū)不同水源水質(zhì)進行研究。選取了龍江河宜州城區(qū)流域源頭、上游、中上游、中游、中下游、下游區(qū)段水源，以及廢水排放量大的生活廢水和繅絲廠廢水共8份水樣進行微核率影響測試。結(jié)果表明，各水樣皆受不同程度污染，龍江河宜州城區(qū)流域水質(zhì)污染存在空間差異。其中，源頭至中游區(qū)段屬中度污染，中下游、下游達重度污染，生活廢水為中度污染，繅絲廠廢水具重度污染。

微核技術；水質(zhì)監(jiān)測；污染指數(shù)

微核(micronucleus，MN)是真核細胞染色體畸變導致的一種異常結(jié)構，主要由于生物受內(nèi)外環(huán)境的遺傳毒性誘變后，染色體斷裂產(chǎn)生無著絲粒斷片或紡錘體受損產(chǎn)生滯后染色體，在細胞分裂時，不能向兩極運動，而在細胞漿中獨立于主核，形成一個或數(shù)個直徑小于主核1/3的核小體，其染色性質(zhì)與主核一致，部分DNA具復制能力，是細胞的一種遺傳學終點[1-3]。有小微核和大微核兩種形式，通常認為小微核由染色體斷片形成，大微核因紡錘體受損造成一條或一組染色體滯后而形成[4]。當外界環(huán)境(物理、化學及生物因素)損害作用達一定程度時，可使細胞發(fā)生遺傳損傷，從而使得微核細胞率(千分率)增加[5]。孟順龍等研究除草劑阿特垃津?qū)a魚的影響，通過外周血紅細胞觀察到微核率與誘變劑存在正相關的劑量效應和時間效應[6]。這種根據(jù)細胞內(nèi)微核現(xiàn)象來判斷外界毒性因素誘導體內(nèi)染色體異常的試驗方法稱為微核技術(micronucleus test, MNT)[7]。該技術簡便、靈敏度高，可直接監(jiān)測環(huán)境污染程度，還能評估污染物對生物體拮抗或疊加等綜合的生物學效應[8]，這是化學法所不能表現(xiàn)的，因而廣泛用于水體污染[9-10]、空氣污染[11]、農(nóng)藥污染[12]、輻射危害[13-14]、食品工業(yè)[15]、化妝品[16]、醫(yī)藥領域[17]等。微核技術起源于20世紀70年代初Boller和Matter等通過嚙齒動物骨髓細胞微核率檢測誘變劑活力的研究[18-19]。自建立以來，經(jīng)不斷改進和發(fā)展[20]，1982年Degrassi等用蠶豆根尖微核檢測淡水中誘變劑的污染，認為該技術準確、快速并適合大批量樣品檢測等，因而建立了蠶豆根尖微核檢測系統(tǒng)[21]。該技術為環(huán)境污染特別是水質(zhì)污染和致突變劑檢測研究帶來極大便利，1986年我國將蠶豆微核技術引入《環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》的水環(huán)境監(jiān)測中，該技術也是國際規(guī)范的監(jiān)測方法[22]。劉萍等還將蠶豆微核技術與常規(guī)水體污染指標進行了相關性比較研究，表明綜合評價結(jié)果相一致[23]。

龍江河屬珠江水系西江支流柳江的最大支流，是宜州市境內(nèi)最大的河流，也是主要水資源，其水環(huán)境狀況影響當?shù)鼐用竦纳罴爱a(chǎn)業(yè)發(fā)展。因其流經(jīng)南丹、環(huán)江、金城江等地，而這些地區(qū)皆有許多正在開采的礦山，其水質(zhì)極易受重金屬等污染。2012年，龍江河發(fā)生的罕見鎘濃度嚴重超標事件，引起社會高度關注，鎘等重金屬污染不僅影響當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境,更威脅居民的生活健康及生產(chǎn)[24]；2014年龍江河再次重金屬含量超標，令龍江河下游群眾大為不安[25]。因此迫切需要對龍江河水質(zhì)進行定期監(jiān)測。利用蠶豆微核技術對龍江河宜州城區(qū)流域水質(zhì)，宜州城區(qū)繅絲廠廢水和生活廢水水質(zhì)的檢測，能夠從生物學角度綜合評估宜州城區(qū)水質(zhì)的狀況，對掌握宜州城區(qū)水體環(huán)境及水質(zhì)動態(tài)變化具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

青皮蠶豆(安徽阜陽市售)。

1.2方法

1.2.1樣點選擇與水樣采集

(1)龍江河廣西宜州城區(qū)流域由西向東依次按源頭(龍A)、上游(龍B)、中上游(龍C)、中游(龍D) 、中下游(龍E) 、下游(龍F)六個區(qū)段分別取樣，其采集地標分別為：龍A(E 108.561°，N 24.529°)，龍B(E 108.624°，N 24.505°)，龍C(E 108.640°，N 24.502°)，龍D(E 108.656°，N 24.499°)，龍E(E 108.666°，N 24.497°)，龍F(E 108.672°，N 24.496°)，皆無臭味；

(2)宜州城區(qū)某繅絲廠廢水(E 108.604°, N 24.502°)，惡臭；

(3)宜州城區(qū)生活廢水(E 108.660°，N 24.502°)，微臭味。

水樣采集時間為2015年5月，用棕色試劑瓶各采集500 mL，帶回實驗室后立即使用。

1.2.2對照設置

陽性對照：0.5 g/L重鉻酸鉀溶液。

陰性對照：蒸餾水。

1.2.3蠶豆萌發(fā)

選取顆粒飽滿，大小一致的青皮蠶豆于恒溫培養(yǎng)箱25 ℃條件下用蒸餾水浸泡約24 h，期間換水2次(用于更換的蒸餾水同放恒溫培養(yǎng)箱中預熱)，待其充分吸脹后，選取種孔開裂的青皮蠶豆平鋪于兩層濕潤脫脂棉紗布中層進行催芽，每隔12 h換水1次。約24 h后進行一次篩選，選取初生根長勢一致(約2.5 mm)的青皮蠶豆繼續(xù)催芽，約48 h后，初生根長至1.5～2 cm，根毛發(fā)育良好。

1.2.4蠶豆根尖處理

將初生根長勢一致的青皮蠶豆，隨機分裝至10面培養(yǎng)皿中，每面15顆。將8個待測水樣及2個對照處理水樣搖勻后分別倒入培養(yǎng)皿，以蠶豆根尖浸沒即可?？凵吓囵B(yǎng)皿蓋后放入盛水托盤，再用濕潤脫脂棉紗布蓋住培養(yǎng)皿，邊緣浸沒于托盤水中，以防處理液蒸發(fā)。于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中處理24 h后，用蒸餾水浸洗3次，每次4 min，再于25 ℃蒸餾水中恢復培養(yǎng)24 h便可進行取材固定。

1.2.5蠶豆根尖微核檢測

剪取1 cm根尖，置于5 mL離心管中，用卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，期間換固定液2次，之后移入70%乙醇中(暫不進行制片的可于4 ℃保存)。隨機抽取每個處理中固定好的蠶豆根尖9個(每個重復取三個根尖，每個處理三個重復，取平均值)，用去離子水浸洗2次，每次5 min ，吸凈蒸餾水后加6 mol/L鹽酸于室溫酸解20 min，待幼根軟化方可棄去鹽酸(用濾紙吸凈)，用蒸餾水浸洗3次，每次2 min。截取2 mm根尖于載玻片滴加改良苯酚品紅染液[26]，染色15 min后換以蒸餾水，先用解剖針將根尖撕碎，加蓋玻片(再蓋上一小塊濾紙利于敲打)，垂直輕敲蓋玻片進行壓片。最后將制好的裝片于顯微鏡成像系統(tǒng)(OLYMPUS BX51，40×10)鏡檢，每個重復約1 000個細胞(每個根尖隨機拍照5張，每個重復3個根尖共15張照片)，記錄微核細胞數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

微核率(MN)‰=有微核細胞數(shù)/總觀察細胞數(shù)×1000 ‰

污染指數(shù)(PI)=樣品實測MN‰平均值/去離子水(陰性對照)MN‰平均值

據(jù)《全國生物技術檢測規(guī)范—蠶豆根尖微核技術》規(guī)定，以PI值劃分受污染程度[27]，劃分標準見表1。

表1　污染指數(shù)(PI)評價水質(zhì)標準

注：數(shù)值在上、下限時定為上一級污染。

不同水樣處理蠶豆根尖微核率的影響采用Microsoft Excel 2007作折線圖分析，方差分析和多重比較采用SAS9. 0軟件，Bon法[28]進行統(tǒng)計。

2　結(jié)果與分析

2.1不同水樣處理對蠶豆根尖細胞生長的影響

蠶豆根尖細胞經(jīng)各水樣處理皆可鏡檢到微核現(xiàn)象存在，各產(chǎn)生微核情況不同，處理結(jié)果明顯，見圖1。

圖1　不同水樣對蠶豆根尖微核誘變的顯微觀察a.無微核； b.小微核； c.大微核； d.雙微核

2.2水樣受污染程度統(tǒng)計

表2　水樣受污染程度統(tǒng)計

由表2各可知，各水樣皆受不同程度污染。龍江河宜州城區(qū)流域水環(huán)境整體受污染，其源頭(龍A)即屬中度污染，中下游及下游區(qū)段(龍E和龍F)受污染程度達重度污染，其余區(qū)段皆受中度污染。生活廢水可帶來中度污染，繅絲廠廢水能造成重度污染。

2.3龍江河宜州城區(qū)流域不同區(qū)段水質(zhì)對蠶豆根尖微核率的影響

圖2　龍江河宜州城區(qū)流域不同區(qū)段水樣對蠶豆根尖微核率的影響

由圖2可知，龍江河宜州城區(qū)流域各采樣點水質(zhì)對蠶豆根尖微核率的影響順水流方向趨勢逐步升高，表明龍江河水體受宜州城區(qū)的污染作用，且存在空間差異，因龍江河流經(jīng)宜州城區(qū)中央而過，沿途接受城區(qū)排放的所有廢水。其源頭至中游區(qū)段微核率有微弱降低趨勢，但中游至下游區(qū)段微核率表現(xiàn)較明顯的增加趨勢。這是由于城市廢水污染的富集作用，加之源頭已受中度污染，致使污染程度迅速增強，最終造成龍江河宜州城區(qū)流域水環(huán)境受到嚴重污染。

2.4各水樣對蠶豆根尖微核率影響的多重比較

表3　不同水樣對蠶豆根尖微核率影響的多重比較

注：表中數(shù)據(jù)為(平均值 ± 標準差)，小寫字母代表0.05 水平，大寫字母代表0.01水平。

由表3可知，不同水樣對蠶豆根尖微核率的影響存在差異。皆與陰性對照(無污染)差異達極顯著水平(F﹤0.01，p﹤0.01)；繅絲廠廢水與龍江河宜州城區(qū)流域下游區(qū)段水質(zhì)污染程度與陽性對照(重度污染)無極顯著差異，表明這兩種水樣重度污染程度相當嚴重，其次受重度污染的是龍江河中下游區(qū)段水體。龍江河宜州城區(qū)流域源頭至中游區(qū)段整體受污染程度存在差異但未達極顯著水平，其中污染程度最低的中上游及中游區(qū)段所受污染水平與直接排放的生活廢水相當，表明龍江河整體水環(huán)境受較高程度污染。

3　討論

城市離不開賴以生存的水資源。城區(qū)的生活、工農(nóng)業(yè)等無不得益于河流而發(fā)展，穿城而過的江河受到城市的作用導致水質(zhì)改變，因此城市與江河互為影響。而城市如果忽略可持續(xù)發(fā)展，往往對江河污染帶來重創(chuàng)甚至不可逆。2012年龍江河宜州市境內(nèi)曾發(fā)生的鎘濃度嚴重超標事件[24]。在拉浪水電站前方200m處，鎘含量超標約80倍，被專家稱為“世界罕見”。當?shù)卣扇⊥斗攀曳酆途酆下然X的措施，利用鎘離子在堿性條件下形成難溶的氫氧化鎘沉淀而去除水中鎘含量，但相關專家還是提出了質(zhì)疑，表示重金屬污染能導致在環(huán)境里永遠循環(huán)無法降解，并具富集性，是不可逆轉(zhuǎn)的[29]。2014年龍江河鎘污染事件再次爆發(fā)，鎘、鋅濃度分別超標8倍和9倍[25]。表明龍江河易受重金屬污染，龍江河發(fā)源于貴州，沿途皆為喀斯特地貌，流經(jīng)多個重金屬廠礦地區(qū)，在尚未進入城區(qū)的源頭A位點水質(zhì)已屬中度污染。

生活廢水主要污染源為排泄物、洗滌劑等。李宗蕓等[30]通過8種家用洗潔精對蠶豆根尖毒性效應的研究發(fā)現(xiàn)6種洗潔精濃度在0.1%時可使得蠶豆根尖細胞微核率顯著上升，濃度在1%～10%時8種洗潔精皆可使蠶豆根尖發(fā)黑，初生根變形，表明洗滌用品可污染水源，并且生活廢水中富含有機質(zhì)的排泄物可使有害微生物增生等，對河流具一定污染作用。本試驗生活廢水水質(zhì)檢測結(jié)果為中度污染。

蠶絲加工過程中，繅絲和汰頭等是產(chǎn)生廢水的環(huán)節(jié)?？壗z耗水量大，汰頭廢水含豐富蛹油等高分子有機物，腐敗發(fā)酵產(chǎn)生惡臭，被繅絲廠作為廢水排放，大量消耗河道溶氧，破壞水質(zhì)，造成污染[31]。有學者研究出酸堿水解法[32]、A2O+濾布濾池工藝[33]、NaOH改性杉木屑處理[31]等方法能有效處理繅絲廠廢水。宜州是國內(nèi)最大的桑蠶生產(chǎn)縣級市，蠶絲加工廢水量大。本次取樣檢測出重度污染，需引起重視，應加以充分處理后排放，以降低對城區(qū)環(huán)境及龍江河水源的污染。

由于宜州城區(qū)生活廢水、工業(yè)及醫(yī)院等廢水排放的富集作用終于導致龍江河宜州城區(qū)中下游至下游區(qū)段重度污染。

4　結(jié)論

通過蠶豆根尖微核技術能有效的監(jiān)測宜州城區(qū)水質(zhì)情況，對實時掌握宜州城區(qū)水質(zhì)、江河水體環(huán)境及動態(tài)變化具有可實踐意義。

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[Abstract]Vicia-micronucleus test was applied to monitor the water quality of Yizhou city. 8 water samples were selected from the headwater, upper reaches, upper and middle reaches, middle reaches, middle and lower reaches, lower reaches of Longjiang River’s Yizhou city basin, and from the domestic wastewater and silk factory wastewater which discharge a large amount of wastewater. The micronucleus rate was monitored for the 8 water samples. The results show that all the water samples were polluted to different degree. The pollution of Longjiang River’s different sections has spatial variability. The headwater to middle reaches are under moderate pollution; the middle and lower reaches, lower reaches are heavily polluted; domestic wastewater is under moderate pollution; the silk factory wastewater suffers from heavy pollution.

[Key words]micronucleus test； water quality； pollution index(PI)

[責任編輯劉景平]

Utilization of Micronucleus Test to Monitor the Water Quality of Yizhou City

HE Qing-mei1， WANG Xu-tong2， XIE Yan-jun1， HUANG Cheng-xiao1，YANG Xiao-qing1, LI Shi-biao1

(1.College of Chemical and Biological Engineering, Hechi University, Yizhou, Guangxi 546300，China;2. No.54 Middle School of Lanzhou， Lanzhou, Gansu 730030，China)

X522

A

1672-9021(2016)02-0017-06

賀慶梅(1985-)，女，江西吉安人，河池學院化學與生物工程學院講師，主要研究方向：植物修復與植物資源利用。

河池學院環(huán)境工程專業(yè)碩士點建設學科資助項目(2015HJB008)。

2016-01-11