基于COI及Cytb基因的6種蜚蠊分子系統(tǒng)關(guān)系

陳壯志，何　苗,3，張成桂,3，楊　紅，閆　爽，趙海榮,3，李成功,3，巫秀美,3

(1 大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院，云南　大理　671000；2 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　大理　671000；3 中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，大理大學(xué)，云南　大理　671000)

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基于COI及Cytb基因的6種蜚蠊分子系統(tǒng)關(guān)系

陳壯志1,2，何苗1,2,3，張成桂1,2,3，楊紅1,2，閆爽1,2，趙海榮1,2,3，李成功1,2,3，巫秀美1,2,3

(1 大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院，云南大理671000；2 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；3 中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，大理大學(xué)，云南大理671000)

對(duì)美洲大蠊等6種蜚蠊的線(xiàn)粒體COI和Cytb基因序列進(jìn)行了分析，6種蜚蠊的COI基因片段長(zhǎng)度為659 bp，共存在221個(gè)核苷酸位點(diǎn)變異，變異率為33.54%；6種蜚蠊的Cytb基因片段長(zhǎng)度均為433 bp，共存在154個(gè)核苷酸位點(diǎn)變異，變異率為35.57%。本文以蜚蠊目近緣昆蟲(chóng)Neocapritermestaracua為外群，對(duì)COI和Cytb兩個(gè)基因合并序列采用Neighbor-Joining法和Minimum Evolution法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。結(jié)果顯示：兩種方法均能區(qū)分美洲大蠊和另外5種蜚蠊，美洲大蠊和黑胸大蠊親緣關(guān)系比較近。

美洲大蠊；線(xiàn)粒體；COI；Cytb；分子系統(tǒng)樹(shù)

動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA(mtDNA, Mitochondrial DNA)基因序列是研究屬、種間系統(tǒng)發(fā)育較好的分子標(biāo)記[1]。細(xì)胞色素C氧化酶I基因(Cytochrome c oxidase subunit I,COI)由于其廣泛分布在不同物種中的線(xiàn)粒體基因中，并且COI基因具有相對(duì)保守的序列和結(jié)構(gòu)，所以其在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)的研究中應(yīng)用較為廣泛[2-8]。而線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因(Cytb)是線(xiàn)粒體DNA上的蛋白質(zhì)編碼基因，其進(jìn)化速度適中，適于進(jìn)行種間和屬間親緣關(guān)系的研究，也是探討動(dòng)物類(lèi)群的分類(lèi)研究和系統(tǒng)進(jìn)化的良好標(biāo)記[9-17]。

美洲大蠊(Periplanetaamericana)為昆蟲(chóng)綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，其入藥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并把它列為中品，謂“味：咸、寒；治：血瘀癥堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無(wú)子”[18]，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)藥材。美洲大蠊具有多種藥理作用，比如抗腫瘤、強(qiáng)心升壓、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織修復(fù)、抗菌及抗病毒作用[19]。

本文對(duì)美洲大蠊、黑胸大蠊(Periplanetafuliginosa)、日本姬蠊(Blattellabisignata)、德國(guó)小蠊(Blattellagermanica)、遺存隱尾蠊(Cryptocercusrelictus)和中華真地鱉(Eupolyphagasinensis)6種蜚蠊線(xiàn)粒體DNA的COI和Cytb基因部分片段進(jìn)行比對(duì)，利用生物信息學(xué)分析手段，探討Cytb及COI基因在6種蜚蠊中的分子進(jìn)化機(jī)制，以蜚蠊目近緣昆蟲(chóng)Neocapritermestaracua為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，依據(jù)分子生物學(xué)原理確定6種蜚蠊的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，為蜚蠊類(lèi)的分類(lèi)鑒定和基因變異研究提供分子生物學(xué)方面的依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)中，美洲大蠊的DNA序列由對(duì)PCR產(chǎn)物基因測(cè)序得到，黑胸大蠊、德國(guó)小蠊、日本姬蠊、遺存隱尾蠊、中華真地鱉的DNA序列來(lái)自GenBank。材料和DNA數(shù)據(jù)的具體來(lái)源見(jiàn)表1。

表1　實(shí)驗(yàn)所需樣品或數(shù)據(jù)來(lái)源

續(xù)表1

黑胸大蠊蜚蠊科GenbankNo.:AB126004.1德國(guó)小蠊姬蠊科GenbankNo.:EU854321.1日本姬蠊姬蠊科GenbankNo.:JX233805.1遺存隱尾蠊隱尾蜚蠊科GenbankNo.:JX144941.1中華真地鱉鱉蠊科GenbankNo.:FJ830540.1

1.2基因組總DNA的提取

本實(shí)驗(yàn)選取美洲大蠊胸部肌肉組織為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA提取，提取方法采用苯酚-氯仿法[20]。

1.3PCR擴(kuò)增目的片段

以提取的總DNA為模板，采用引物L(fēng)CO1490、HCO2198或CB-J-10993、CB-N-11367(表2)用MyCycler Thermal Cycler型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)擴(kuò)增藥用美洲大蠊的DNA序列。PCR反應(yīng)的總體積為50 μL，其中包括上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 4 μL，2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司)25 μL，加滅菌雙蒸水至終體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃變性45 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離所得PCR產(chǎn)物，并使用DNA凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)純化。PCR擴(kuò)增之后由上海生工生物工程有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2　引物列表

1.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定

COI和Cytb基因的PCR產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序。測(cè)序引物由上海生工公司合成。COI和Cytb基因的測(cè)序引物同PCR反應(yīng)引物。

1.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX 1.81[23]軟件對(duì)測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。序列比對(duì)完畢后，采用MEGA 5.2[24]軟件對(duì)序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換率、顛換率和樣品間遺傳距離進(jìn)行分析。用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ method)[25]和最小進(jìn)化法(Minimum Evolution, ME method)[26]構(gòu)建COI和Cytb基因的系統(tǒng)樹(shù)，同時(shí)各分支的支持率由Bootstrap(1 000次重復(fù))計(jì)算。

2　結(jié)果與討論

2.16種蜚蠊COI基因片段序列分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)從美洲大蠊總DNA中成功擴(kuò)增出COI基因片段，長(zhǎng)度約為700 bp。使用Clastal X1.81軟件將測(cè)序所得COI序列進(jìn)行比對(duì)校正，去除基因片段兩端引物序列，獲得的基因序列長(zhǎng)度為659 bp。美洲大蠊與其他5種蜚蠊COI基因序列對(duì)比，檢測(cè)到發(fā)生變異的堿基位點(diǎn)數(shù)為221，變異率為33.54%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)為144，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基的缺失以及插入。堿基A、T、G、C的平均含量分別為31.1%，34.1%，16.4%和18.4%。A+T的平均含量為65.2%，高于G+C。由表1可知序列中的轉(zhuǎn)換率(50%)等于顛換率(50%)。

基于COI基因序列，由Kimura 2-Parameter法計(jì)算種間遺傳距離(表4)，結(jié)果表明最遠(yuǎn)的遺傳距離出現(xiàn)在美洲大蠊與中華真地鱉之間，而最近的遺傳距離出現(xiàn)在美洲大蠊與黑胸大蠊之間。

表3　6種蜚蠊CO I DNA序列的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)統(tǒng)計(jì)

注：表中數(shù)字信息為每100個(gè)變異位點(diǎn)中發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)換或顛換的個(gè)數(shù)。

表4　基于CO I基因序列6種蜚蠊種間遺傳距離

2.26種蜚蠊Cytb基因片段序列及差異

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)從美洲大蠊總DNA中成功擴(kuò)增出Cytb基因片段，長(zhǎng)度約為480 bp。使用Clastal X 1.81軟件將測(cè)序所得Cytb序列進(jìn)行比對(duì)校正，去除基因片段兩端引物序列，獲得的基因序列長(zhǎng)度為433 bp。美洲大蠊與其他5種蜚蠊Cytb基因序列對(duì)比，檢測(cè)到發(fā)生變異的堿基位點(diǎn)數(shù)為154，變異率為35.6%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)為103，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基的缺失以及插入。堿基A、T、G、C的平均含量分別為32.7%，36.8%，12.2%和18.3%。A+T的平均含量為69.5%，高于G+C。由表3可知序列中的轉(zhuǎn)換率(52.5%)大于顛換率(47.6%)。

基于Cytb基因序列，由Kimura 2-Parameter法計(jì)算種間遺傳距離(表6)，結(jié)果表明最遠(yuǎn)的遺傳距離出現(xiàn)在美洲大蠊與日本姬蠊之間，而最近的遺傳距離出現(xiàn)在美洲大蠊與黑胸大蠊之間。

表5　6種蜚蠊Cyt b DNA序列的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)統(tǒng)計(jì)

注：表中數(shù)字信息為每100個(gè)變異位點(diǎn)中發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)換或顛換的個(gè)數(shù)。

表6　基于Cyt b基因序列6種蜚蠊種間遺傳距離

2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將實(shí)驗(yàn)所得的6種蜚蠊COI基因序列和Cytb基因序列的片段一一對(duì)應(yīng)合并，然后以蜚蠊目的關(guān)系較近的等翅目昆蟲(chóng)Neocapritermestaracua(GenBank No.: NC_026116.1)的同源序列作為外群，基于Kimura 2-Parameter模型，采用鄰接法和最小進(jìn)化法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)置信度由Bootstrap(1000次重復(fù))計(jì)算，以檢驗(yàn)各分支的支持率(圖1)。

圖1　基于線(xiàn)粒體CO I基因和Cyt b基因部分序列構(gòu)建的6種蜚蠊系統(tǒng)樹(shù)

3　討　論

3.1目的基因片段的組成

本實(shí)驗(yàn)中，COI和Cytb基因序列中的鳥(niǎo)嘌呤(G)含量均較低，而A+T的含量均高于G+C的含量，為典型的動(dòng)物線(xiàn)粒體基因序列特征[27]，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)用于蜚蠊目系統(tǒng)分析的序列是有效的和準(zhǔn)確的。

3.26種蜚蠊系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

本研究以蜚蠊目的關(guān)系較近的等翅目昆蟲(chóng)白蟻Neocapritermestaracua作為外群構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，并使用最小進(jìn)化法和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行6種蜚蠊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，分析結(jié)果說(shuō)明：大蠊屬內(nèi)的美洲大蠊與黑胸大蠊構(gòu)成一支，這與形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法一致；兩進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也是基本相同。本實(shí)驗(yàn)中使用COI和Cytb基因聯(lián)合對(duì)6種蜚蠊之間的遺傳距離進(jìn)行分析，結(jié)果表明大蠊屬內(nèi)美洲大蠊與黑胸大蠊的遺傳距離為0.121～0.127，遺傳距離較大甚至達(dá)到了科間分類(lèi)級(jí)別，這可能是由于蜚蠊目物種進(jìn)化速度不快并較為古老，同時(shí)也說(shuō)明運(yùn)用COI和Cytb基因聯(lián)合分析法可以對(duì)6種蜚蠊進(jìn)行分類(lèi)。但在本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有比對(duì)所有蜚蠊類(lèi)群的相關(guān)序列，所以對(duì)相關(guān)序列對(duì)屬間分類(lèi)的準(zhǔn)確性還需要進(jìn)一步的考量。

4　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種蜚蠊線(xiàn)粒體DNA的COI和Cytb基因序列進(jìn)行了相關(guān)分析，分析表明COI和Cytb基因能夠很好地對(duì)6種蜚蠊進(jìn)行種類(lèi)鑒定，其基因序列也較為保守。本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果有助于完善蜚蠊目的分類(lèi)體系，為探討蜚蠊目昆蟲(chóng)的分子進(jìn)化提供一定的參考。

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Phylogenetic Relationship of 6 Blattaria Species Based on MitochondrialCOIandCytbGenes Sequences*

CHENZhuang-zhi1,2,HEMiao1,2,3,ZHANGCheng-gui1,2,3,YANGHong1,2,YANShuang1,2,ZHAOHai-rong1,2,3,LICheng-gong1,2,3,WUXiu-mei1,2,3

(1 Institute of Entomoceutics Research, Dali University, Yunnan Dali 671000; 2 Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Yunnan Dali 671000; 3 Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Yunnan Dali 671000, China)

MitochondrialCOIandCytbgenes sequences of 6 Blattaria species were analyzed. The results showed that theCOIgene segments length was 659 bp for studied insects. There were 224 nucleotide variation sites with the variation rate of 33.54%. The length ofCytbgene segments were 433 bp, containing 154 nucleotide variation sites with a variation rate of 35.57%.Neocapritermestaracua, as the outgroup, used Neighbor-Joining method and Minimum Evolution method to study the union sequences ofCOIandCytband to construct Blattaria’s molecular phylogenetic trees. It was suggested that the 2 methods analyses could be used in species identification ofPeriplanetaAmericanaand its closely related species. Accordant with the result derived from traditional classification system, our study revealed that the genetic relationship ofPeriplanetaamericanaand Periplaneta fuliginosa was nearer than with others.

Periplanetaamericana; mitochondria;COI;Cytb; phylogenetic tree

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360679)；藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：云發(fā)改高技[2015]395)；云南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金([2013]1527)；云南省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目([2012]1956)；云南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目([2012]25)；云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(項(xiàng)目編號(hào)：2015DG030)。

陳壯志(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)和生物信息學(xué)。

巫秀美，女，博士、碩士生導(dǎo)師，主要從事分子醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)、藥物流行病學(xué)和生物信息學(xué)的研究。

TQ460

A

1001-9677(2016)010-0048-04