基于COI和18SrRNA基因?qū)︱泱刮锓N進(jìn)行分子鑒定*

陳壯志，楊志斌,3，李貴軻，劉　衡,3，陳　丹，高鵬飛,3，張成桂,3

(1 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南　大理　671000；2 中國(guó)西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，大理大學(xué)，云南　大理　671000；3 藥用特種昆蟲開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南　大理　671000；4 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，四川　成都　615000)

?

分析測(cè)試

基于COI和18SrRNA基因?qū)︱泱刮锓N進(jìn)行分子鑒定*

陳壯志1,2，楊志斌1,2,3，李貴軻3,4，劉衡1,2,3，陳丹1,2，高鵬飛1,2,3，張成桂1,2,3

(1 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；2 中國(guó)西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，大理大學(xué)，云南大理671000；3 藥用特種昆蟲開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南大理671000；4 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，四川成都615000)

為從分子水平上明確藥用美洲大蠊在分類學(xué)上的地位，采用分子克隆和序列比對(duì)的方法，對(duì)云南大理產(chǎn)美洲大蠊的COI基因和18SrRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定，并同蜚蠊科相關(guān)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，通過鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)和最小進(jìn)化法(Minimum evolution method, ME)構(gòu)建的系統(tǒng)樹基本一致，證實(shí)COI能對(duì)美洲大蠊及其近緣物種進(jìn)行有效的物種分子鑒定，而18SrRNA不能進(jìn)行有效的分子鑒定。

美洲大蠊；COI基因；18SrRNA基因；系統(tǒng)進(jìn)化分析

美洲大蠊(Periplanetaamericana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)藥材，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并把它列為中品，謂“味：咸、寒；治：血瘀癥堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無(wú)子”。美洲大蠊具有多種藥理作用，比如如抗腫瘤、改善微循環(huán)、強(qiáng)心升壓、抗菌及抗病毒作用和促進(jìn)組織修復(fù)等[1]。傳統(tǒng)的藥用美洲大蠊分類研究主要以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，但由于藥用美洲大蠊炮制品大多殘缺不全，容易混入偽品，給準(zhǔn)確的藥材鑒定帶來(lái)許多困難。DNA條形碼方法由于不受樣品形態(tài)的限制，彌補(bǔ)了昆蟲藥材在形態(tài)鑒定上的缺陷，是形態(tài)學(xué)鑒定美洲大蠊以有力的補(bǔ)充，可更加準(zhǔn)確有效地鑒定昆蟲藥材炮制品[2-4]。

本研究利用線粒體COI基因和細(xì)胞核18SrRNA基因，對(duì)藥用美洲大蠊及其近緣物種等6種蜚蠊的這兩個(gè)基因序列特征進(jìn)行分析，并對(duì)它們分子分類的有效性進(jìn)行比較和探討，為美洲大蠊藥材的準(zhǔn)確分類提供依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1樣品采集

本研究共收集云南省大理州大理大學(xué)昆蟲醫(yī)藥研究院作邑養(yǎng)殖基地產(chǎn)美洲大蠊實(shí)驗(yàn)樣本5個(gè)。實(shí)驗(yàn)樣本均根據(jù)《中國(guó)動(dòng)物志》及《中國(guó)藥典》，經(jīng)大理大學(xué)楊自忠教授進(jìn)行鑒定。

1.2基因組DNA提取

取單個(gè)美洲大蠊約50 mg的胸部肌肉，采用SDS-蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取總DNA[5]提取的 DNA置于-20 ℃保存。

1.3PCR擴(kuò)增

COI基因、18SrRNA基因的引物序列設(shè)計(jì)分別參照Vrijenhoek[6]和Tautz等[7]的研究。COI基因的引物序列為:LCO1490 5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’，HCO2198 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’；18SrRNA基因的引物序列為：18S-ai 5’-CCT GAG AAA CGG CTA CCA CAT C-3’，18S-b0.5 5’-GTT TCA GCT TTG CAA CCA T-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，PCR擴(kuò)增在MyCycler Thermal Cycler 型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行。反應(yīng)體積為50 μL，包含2×Taq PCR MasterMix 25 μL(天根生化科技(北京)有限公司)，10 μmol/L引物L(fēng)CO1490、HCO2198或18S-ai、18S-b0.5各1 μL，模板DNA約50 ng，滅菌ddH2O補(bǔ)足至終體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增條件依次為：94 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)的94 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸7 min；4 ℃保溫。同時(shí)以滅菌ddH2O代替模板DNA作陰性對(duì)照。取2 μL PCR產(chǎn)物上樣至1.2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)，其余置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?duì)于擴(kuò)增無(wú)雜帶，目的條帶明亮的PCR產(chǎn)物送交上海生工生物有限公司測(cè)序。COI基因采用雙向測(cè)序、測(cè)序引物為L(zhǎng)CO1490、HCO2198，18SrRNA基因則采用單向測(cè)序，測(cè)序引物為18S-ai、18S-b0.5。

1.4序列分析和數(shù)據(jù)處理

用DNASTAR軟件包中的SeqMan軟件對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行校對(duì)和編輯,并在美國(guó)生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站的Genbank中搜尋最相關(guān)序列，選取蜚蠊科及用于做外群昆蟲的相應(yīng)序列(表1)，借助在線Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[8]進(jìn)行對(duì)位排列。運(yùn)用MEGA 5.2軟件，根據(jù)Kimura 2-parameter模型分別構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)和ME(Minimum evolution)系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap(重復(fù)數(shù)=1000)檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。

表1　6種蜚蠊目昆蟲Genbank序列號(hào)Table 1　GenBank Numbers of the CO I and 18S rRNAsequences of Blattaria

續(xù)表1

蜚蠊科Blattidae東方蜚蠊BlattaorientalisAM114926.1AY521830.1側(cè)緣雪蠊ShelfordellalateralisJQ267493.1DQ874114.1姬蠊科Blattellidae德國(guó)小蠊BlattellagermanicaJQ350728.1DQ874114.1

2　結(jié)果與討論

2.1COI和18SrRNA基因序列特征

通過美洲大蠊總DNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序，分別得到5個(gè)美洲大蠊清晰單一的COI基因、18SrRNA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物，5個(gè)美洲大蠊個(gè)體的COI基因和18SrRNA基因序列測(cè)定結(jié)果完全相同。與蜚蠊科其他5種昆蟲序列比對(duì)，分別選取COI和18SrRNA基因序列中沒有任何堿基插入、缺失的602 bp和751 bp(分別編碼和250個(gè)氨基酸)的序列片段進(jìn)行分析。其中COI基因有140個(gè)變異位點(diǎn)、84個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、462個(gè)不變位點(diǎn)，分別占分析序列堿基的23.26%，19.95%，76.74%。18SrRNA基因有2個(gè)變異位點(diǎn)、0個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、748個(gè)不變位點(diǎn)，分別占分析序列堿基的0.27%，0，99.60%?？勺兾稽c(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)的百分比COI均要高于18SrRNA基因。

蜚蠊科6種昆蟲COI和18SrRNA基因平均GC含量特征有很大不同，分別為34.87%和53.35%，COI基因中GC含量低于AT的平均百分含量(65.13%)，表現(xiàn)出線粒體蛋白編碼基因的明顯偏倚性。18SrRNA基因密碼子各位點(diǎn)的平均GC含量為第二位最高、第一位最低，但COI基因第一、二和三密碼子位點(diǎn)的平均GC含量均低于18SrRNA基因的相應(yīng)位點(diǎn)。黑胸大蠊第3位GC含量(8.50%)在蜚蠊科6種昆蟲的2種基因中均是最低的(表2)。

表2　蜚蠊科6種昆蟲CO I、18S rRNA基因序列片段平均GC含量Table 2　The GC average contents of CO I and 18S rRNA gene sequences for 6 species in the order Blattidae 　(%)

續(xù)表2

東方蜚蠊Blattaorientalis34.3947.7644.2811.0053.4751.0056.0053.41側(cè)緣雪蠊Shelfordellalateralis36.2146.7744.7817.0053.3350.6056.0053.41平均值(Meanvalue)34.8747.4644.7312.3053.3550.6456.0053.41

所有個(gè)體COI和18SrRNA基因序列變異位點(diǎn)信息見表2。相同對(duì)百分比在COI和18SrRNA基因序列中均為90%以上，18SrRNA基因中更是高達(dá)99.87%，密碼子第3位的相同對(duì)百分比均最低，而第1、2位非常近似；對(duì)于COI基因轉(zhuǎn)換和顛換多出現(xiàn)在密碼子的第3位和第1位，其顛換100%來(lái)自第3位密碼子，而18SrRNA基因序列中沒有轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)(表3)。

表3　蜚蠊科6種昆蟲CO I和18S rRNA基因序列片段各密碼子位點(diǎn)堿基變異表Table 3　The sequence variation of the CO I and 18S rRNA genes for 6 species in the order Blattidae

注: “/”的前者為數(shù)值，后者為百分比。

2.2遺傳距離

種間和種內(nèi)遺傳距離大小是物種判定的主要標(biāo)準(zhǔn)。基于COI基因序列的美洲大蠊與其余5種蜚蠊科昆蟲種間遺傳距離(表4)在0.102～0.164之間，美洲大蠊種內(nèi)遺傳距離在0～0.020之間，前者均大于后者。基于18SrRNA基因序列的美洲大蠊與其余5種蜚蠊科昆蟲種間遺傳距離(表5)在0～0.003之間，美洲大蠊種內(nèi)遺傳距離在為0，前者與后者有遺傳距離的重疊。COI種間遺傳距離均顯著高于Hebert等[9]設(shè)定的2%的遺傳差異。

基于COI和18SrRNA基因序列最大種間遺傳距離均發(fā)生在棕色大蠊與側(cè)緣雪蠊之間(0.164)以及東方蜚蠊和其他5種蜚蠊之間(0.003)。美洲大蠊基于COI基因序列種內(nèi)平均遺傳距離(0.012)高于18SrRNA基因序列(0)。

表4　蜚蠊科6種昆蟲基于CO I基因序列遺傳距離Table 4　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on CO I gene

表5　蜚蠊科6種昆蟲基于18S rRNA基因序列遺傳距離Table 5　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on 18S rRNA gene

續(xù)表5

6澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae0.0000.0000.0000.0000.0007黑胸大蠊Periplanetafuliginosa0.0000.0000.0000.0000.0000.0008棕色大蠊Periplanetabrunnea0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0009東方蜚蠊Blattaorientalis0.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.00310側(cè)緣雪蠊Shelfordellalateralis0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

將獲得的美洲大蠊CO I基因和18S rRNA基因序列，以姬蠊科昆蟲德國(guó)小蠊為外群，分別用于對(duì)美洲大蠊及其近緣物種分別進(jìn)行聚類分析，得到CO I基因和 18S rRNA 基因片段的NJ和ME系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1、圖2)。

基于CO I基因構(gòu)建的NJ和ME兩種系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，只是兩樹的自舉置信水平稍有不同。在兩種系統(tǒng)樹中，美洲大蠊5個(gè)體首先相聚,再與同為大蠊屬的澳洲大蠊、黑胸大蠊和棕色大蠊聚合?；?8S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ和ME兩種系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也基本一致，也是兩樹的自舉置信水平稍有不同。在兩種系統(tǒng)樹中，美洲大蠊5個(gè)體與澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和側(cè)緣雪蠊聚合，自舉置信水平也較高(88)，說(shuō)明利用18S rRNA基因序列不能對(duì)美洲大蠊及其近緣物種進(jìn)行有效分類鑒定。

圖1　基于CO I基因序列構(gòu)建蜚蠊目7種昆蟲Neighbor-Joining樹

圖2　基于18S rRNA基因序列構(gòu)建蜚蠊目7種昆蟲Neighbor-Joining樹

3　結(jié)　論

對(duì)蜚蠊科6種昆蟲CO I和18S rRNA基因序列比較分析發(fā)現(xiàn)，由于CO I基因序列為線粒體基因，18S rRNA為核基因，所以兩種序列存在較多差異性，如:(1)CO I基因序列GC的百分含量較低，表現(xiàn)出明顯的反GC偏倚，而18S rRNA基因中則沒有這種偏倚(在CO I和18S rRNA中GC的百分含量分別為34.87%和53.35%)，CO I的堿基含量分布為典型的昆蟲線粒體基因特征[10]；(2)CO I基因的變異位點(diǎn)較多，而18S rRNA基因的基本無(wú)變異位點(diǎn)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)也是CO I較多，而在18S rRNA中未發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，由此導(dǎo)致美洲大蠊與澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和側(cè)緣雪蠊種內(nèi)種間遺傳距離相近而無(wú)法區(qū)分。但CO I、18S rRNA基因也存在一些相似點(diǎn)：(1)相同對(duì)百分比在CO I和18S rRNA基因序列中均為90%以上；(2)在CO I和18S rRNA基因序列中，相同對(duì)在第1、2和3位密碼子中所占比例相似。通過以上分析可知變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)百分含量在不同基因、不同類別間存在差異，在本研究中，CO I較18S rRNA基因的變異率更高些，而18S rRNA基因基本無(wú)變異。

CO I基因和18S rRNA基因在生物體內(nèi)含量較大且在進(jìn)化過程中較保守，是探討生物高級(jí)分類群系統(tǒng)演化的難得工具，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于昆蟲分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究[11-16]。本課題首先測(cè)定了美洲大蠊其CO I基因、18S rRNA基因序列，結(jié)果表明它們與GenBank上已發(fā)表的美洲大蠊相應(yīng)基因的相似性達(dá)98%以上。CO I基因基因片段的保守性強(qiáng)，同屬內(nèi)各種之間差異較大，種內(nèi)基本無(wú)遺傳變異，適用于美洲大蠊和蜚蠊科其他5種昆蟲的分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析；18S rRNA基因片段的保守性更強(qiáng)，種內(nèi)和同屬各種之間差異基本為0，種內(nèi)種間基本無(wú)遺傳變異，故18S rRNA不能對(duì)美洲大蠊及其近緣物種進(jìn)行分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

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The Molecular Species Identification of Blattaria Based on mtDNACOIand 18SrRNAGene Sequences*

CHEN Zhuang-zhi1,2, YANG Zhi-bin1,2,3, LI Gui-ke3,4, LIU Heng1,2,3, CHEN Dan1,2,GAOPeng-fei1,2,3,ZHANGCheng-gui1,2,3

(1 Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Yunnan Dali 671000;2 Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Yunnan Dali 671000;3 The National-Local Joint Engineering Laboratory for Entomoceutics, Yunnan Dali 671000;4 Gooddoctor Pharmaceutical Group, Sichuan Chengdu 615000, China)

COIand 18SrRNAgenes ofPeriplanetaamericanacollected at Dali, Yunnan Province were cloned and sequenced. The phylogenetic relationships between thePeriplanetaamericanaand its closely related 5 species in the order Blattaria were analyzed. The results showed that the phylogenetic trees were almost identical with methods of NJ (Neighbor-joining) and ME (Minimum evolution). It showed thatCOIgene was a practical molecular marker for species identification ofPeriplanetaamericanaand its closely related species, while 18SrRNAgene failed to be used in species identification.

Periplanetaamericana;COIgene; 18SrRNAgene; phylogenetic analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360679)；云南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目發(fā)展專項(xiàng)資金([2013]1527)；云南省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目([2012]1956)；云南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目([2012]25)。

陳壯志(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)和生物信息學(xué)。

張成桂，男，副教授、博士，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)和生物制藥研究。

TQ460

A

1001-9677(2016)013-0104-05