HPLC方法分析工業(yè)5-氨基酮戊酸鹽酸鹽雜質(zhì)

李海春，高賽男，蔣　蕾，彭海生

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)藥學(xué)院，黑龍江 大慶，163319)

?

HPLC方法分析工業(yè)5-氨基酮戊酸鹽酸鹽雜質(zhì)

李海春，高賽男，蔣蕾，彭海生

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)藥學(xué)院，黑龍江 大慶，163319)

建立HPLC法測(cè)定5-氨基酮戊酸(5-ALA)鹽酸鹽粗品中的雜質(zhì)百分含量.使用帶有DAD檢測(cè)器的安捷倫高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為島津Inertsil ODS-SP 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為離子對(duì)溶液(辛烷磺酸鈉2.16 g、磷酸二氫鈉3.12 g，加水配成1 000 mL溶液，磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.65)-乙腈(82∶18)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；波長205 nm；線性范圍0.2～1.0 mg/mL之間，R2=0.999 2，回收率為104 %，RSD為0.96 %，方法能將主峰與雜質(zhì)峰有效分離，可作為5-ALA鹽酸鹽雜質(zhì)百分含量分析方法.

5-氨基酮戊酸鹽酸鹽；高效液相色譜法；辛烷磺酸鈉；雜質(zhì)

作為一種光動(dòng)力療法的光敏劑，5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)可作為綠色植物激素用于蔬菜的種植[1]，也可以作為綠色農(nóng)藥和除草劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn).有報(bào)道稱它可以作為外用劑治療尖銳濕疣、痤瘡和頑固性扁平疣[2-3]，還可以應(yīng)用到腫瘤的診斷、治療和輔助手術(shù)過程中，例如應(yīng)用在臨床中熒光膀胱鏡的制備，用于膀胱癌的引導(dǎo)切除[4-5]，引導(dǎo)膠質(zhì)瘤的切除[6-7]，以及用于皮膚癌的輔助治療中[8]，據(jù)報(bào)道聯(lián)合光動(dòng)力的5-ALA對(duì)人的卵巢癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞也有殺傷作用[9-10].

5-ALA鹽酸鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的研究與應(yīng)用前景，但目前通過合成或生物手段得到的產(chǎn)品均含有少量雜質(zhì)，掌握提純技術(shù)的公司較少，使純品價(jià)格昂貴，應(yīng)用受限，應(yīng)尋找適宜的提純手段，而提純首先應(yīng)建立良好的分析方法.本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有的分析方法，通過實(shí)驗(yàn)篩選適宜的波長、極性相pH以及極性相與有機(jī)相的比例，建立了一種5-ALA鹽酸鹽雜質(zhì)定量分析的高效液相色譜方法.

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；G13150二極管陣列檢測(cè)器；精密pH計(jì)(賽多科斯科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(ESJ200-4)(沈陽龍騰電子有限公司)；超聲波清洗器(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司).

1.2試藥

5-ALA鹽酸鹽樣品(西安天豐生物科技有限公司)，5-ALA鹽酸鹽對(duì)照品(日本石油株式會(huì)社中央研究院，生產(chǎn)批號(hào)是16-00-306-1)，辛烷磺酸鈉(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，分析純)，三氟乙酸(阿拉丁公司，分析純)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，乙腈、甲醇(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠).

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Inertsil ODS-SP 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津公司)；洗脫方式為等度洗脫，流動(dòng)相由離子對(duì)溶液和乙腈構(gòu)成，體積比為82∶18，其中離子對(duì)溶液的配制方法是：將2.16 g辛烷磺酸鈉和3.12 g磷酸二氫鈉溶于1 000 mL的水后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值到3.65；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長205 nm；進(jìn)樣量為10 μL.

2.2溶液配制

2.2.1對(duì)照品溶液配制

精密稱取5-ALA對(duì)照品200 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到20 mg/mL對(duì)照品溶液；再精密稱取200 mg，置于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到4 mg/mL對(duì)照品溶液.

2.2.2樣品溶液配制

取樣品200 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到20 mg/mL樣品溶液.

2.3方法學(xué)考察

2.3. 1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取水、20 mg/mL的樣品和相同的對(duì)照品溶液，按2.1條件檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖1.從圖1(A)可以看出，水經(jīng)檢測(cè)在保留時(shí)間為2.8 min和3.6 min有兩個(gè)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)于溶劑的正吸收和負(fù)吸收峰，這兩個(gè)峰的面積相對(duì)于樣品峰的峰面積來說很小，可以忽略不計(jì).由圖1(B)的對(duì)照品色譜圖可知，對(duì)照品溶液在保留時(shí)間為2.86 min和5.35 min均有峰出現(xiàn)，但由于保留時(shí)間為2.86 min的峰受到空白溶液正吸收峰的干擾不作為主峰計(jì)算，所以以保留時(shí)間為5.35 min處的吸收峰作為5-ALA鹽酸鹽的定性定量峰.圖1(C)中的樣品溶液檢測(cè)出四個(gè)峰，它們的保留時(shí)間分別在2.86、3.48、4.11、5.35 min左右，分離度均大于1.5，能夠完全分離.對(duì)比圖1(B)、(C)可知，保留時(shí)間為3.48 min和4.11 min的兩個(gè)色譜峰為樣品的雜質(zhì)峰.

A-空白色譜圖，B-對(duì)照品色譜圖，C-樣品色譜圖圖1　系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.3.2線性關(guān)系考察

分別精密移取質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL的5-ALA對(duì)照品原溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL的容量瓶中，用水定容至刻度線后搖勻，依次配成質(zhì)量濃度為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL 的對(duì)照品溶液后，按照2.1的色譜條件進(jìn)樣10 μL，平行進(jìn)樣3次.以峰面積平均值(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，得到5-ALA的線性回歸方程為：Y=446.5X+10.7(r=0.999 6).結(jié)果表明，5-ALA在質(zhì)量濃度范圍0.2～1.0 mg/mL之間線性關(guān)系良好.

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn)

按2.2.1方法配制1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積.結(jié)果RSD為0.21%，表明儀器精密度良好.

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照2.2.2方法配制20.0 mg/mL樣品溶液5份，測(cè)定百分含量：樣品百分含量為97.5 %，RSD為1.68 %.

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取2.3.2項(xiàng)下2、3、4、5#溶液，以5#溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，2、3、4#溶液作為樣品溶液，按表格中的量用移液管取出混合，進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得量A為峰面積，進(jìn)行回收率計(jì)算，具體見表1.

表1　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6穩(wěn)定性

配制1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0、16、24、48 h進(jìn)樣檢測(cè)，考察變化.結(jié)果隨著時(shí)間延長峰面積逐漸增大，但無單獨(dú)的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，說明物質(zhì)在水中不穩(wěn)定，在水中產(chǎn)生的新物質(zhì)峰與原物質(zhì)峰無法分離開，根據(jù)保留時(shí)間得出峰的形狀趨向前沿峰變化，水中產(chǎn)物極性比5-ALA鹽酸鹽強(qiáng).

3　討　論

3.1流動(dòng)相

以256 nm波長檢測(cè)，雜質(zhì)未被檢測(cè)出，不適合作為雜質(zhì)定量分析的檢測(cè)波長.205 nm為波長時(shí)檢測(cè)可觀察到兩個(gè)峰，因此被采用.以三氟乙酸水溶液與乙腈或甲醇為流動(dòng)相，色譜峰為單峰，雜質(zhì)峰被隱藏，不適合作為流動(dòng)相.以水為極性相時(shí)，各條件下5-ALA鹽酸鹽出峰時(shí)間相似，均在 2～3 min之間.以甲醇為非極性相時(shí)，主峰出現(xiàn)雙肩峰，峰型前沿較嚴(yán)重，說明5-ALA鹽酸鹽在甲醇中不穩(wěn)定產(chǎn)生了新的物質(zhì)，乙腈為非極性相無這種現(xiàn)象，可以選用.5-ALA鹽酸鹽極性極強(qiáng)，進(jìn)入反向高效液相色譜柱后出峰時(shí)間與溶劑峰無法區(qū)分，均在2～3 min之間，加入離子對(duì)溶液，可以與溶液中大比例的5-ALA鹽酸鹽形成復(fù)合物增加脂溶性，延長出峰時(shí)間至5.0 min之后，以此峰為主峰進(jìn)行考察，使結(jié)果更加可靠.

3.2進(jìn)樣量

質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL時(shí)進(jìn)樣量20.0 μL主峰峰型對(duì)稱性較差，減小至10.0 μL對(duì)稱性較好.

3.3穩(wěn)定性

配制的樣品溶液經(jīng)時(shí)間延長峰面積不斷升高，保留時(shí)間左移，表明5-ALA鹽酸鹽水溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，不宜長期保存.

3.4pH

pH對(duì)峰型影響較大，pH較低時(shí)右側(cè)主峰為拖尾峰，較高時(shí)為前沿峰，應(yīng)對(duì)此進(jìn)行篩選.

3.5基線

以水進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)，基線出現(xiàn)負(fù)吸收，原因可能是流動(dòng)相里的水與固定相極性相反而形成的負(fù)吸收.

3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

以1.0 mg/mL樣品溶液檢測(cè)雜質(zhì)百分含量時(shí)，質(zhì)量濃度太小，誤差較大，因此使用20.0 mg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè).

[1]徐剛, 劉濤, 高文瑞, 等. 5-氨基乙酰丙酸對(duì)蔬菜生理作用的研究進(jìn)展[J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 26(4): 52-57.

[2]涂平, 鄭和義, 顧恒. 外用鹽酸氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療尖銳濕疣多中心隨機(jī)對(duì)照研究[J]. 中華皮膚科雜志, 2007, 40(2): 67-70.

[3]張玲琳, 王秀麗, 王宏偉, 等. 5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療痤瘡[J]. 中華皮膚科雜志, 2009, 38(2): 78-80

[4]RIEDL C R,DANILTCHENKO D,KOENIG F,etal. Fluorescence endoscopy with 5-aminolevulinic acid reduces the early recurrence rate in bladder cancer [J]. J Urol,2001, 165(4): 1121-1123.

[5]FILBECK T, PICHLMEIER U, KNUECHEL R,etal. Clinically relevant improvement of recurrence-free survival with 5-aminolevulinic acid induced fluorescence diagnosis in patients with superficial bladder tumors[J]. J Urol, 2002, 168(1): 67-71.

[6]李朝暉, 韓亮, 田宇. 5-ALA熒光引導(dǎo)技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤手術(shù)中的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 世界復(fù)合醫(yī)學(xué), 2015, 1(1): 85-90.

[7]陳旭, 雷霆, 李齡. 5-氨基乙酰丙酸熒光引導(dǎo)技術(shù)在惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)治療中的應(yīng)用[J]. 國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志, 2009, 36(5): 408-412.

[8]王元元, 楊亞東, 高楊, 等. 手術(shù)切除聯(lián)合局部光動(dòng)力療法治療皮膚惡性腫瘤的臨床效果[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(7): 682-684.

[9]毛瀅, 沈鏗, 魏薇. 光動(dòng)力學(xué)療法誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系Skov3和宮頸癌細(xì)胞系Hela凋亡的體外研究[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 30(9): 779-783.

[10]韓曉鳳, 曹蘭芳, 鐘濟(jì)華. ALA-PDT誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60凋亡[J]. 中國癌癥毒志, 2007, 17(10): 779-783.

Analysis of impurities of crude 5-aminolevulinic acid hydrochloride by HPLC

LI Hai-chun, GAO Sai-nan, JIANG Lei, PENG Hai-sheng

(Department of Pharmaceutics, Daqing Branch, Harbin Medical University, Daqing 163319, China)

A HPLC method to analyze the impurities of crude 5-aminolevulinic acid (5-ALA) samples was established. HPLC analysis was performed with Agilent liquid chromatograph equipped with DAD detector. An Inertsil ODS-SP analytical column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used to separate the samples. The mobile phase was the mixture of acetonitrile and ion pair solution (18∶82). Sodium octane sulfonate of 2.16 g and monosodium phosphate of 3.12 g were dissolved into 1 000 mL water, and then the pH value of solution was regulated to 3.65 to be used as ion pair solution. The detection wavelength was 205 nm and the column temperature was kept at 30 ℃. The linear relationship was between 0.2 and 1.0 mg/mL (R2=0.999 2). The average recoveries of 5-ALA was 104% (RSD=0.96%). The protocol was able to separate all the compositions of crude 5-ALA, monitoring the purity of 5-ALA.

5-Aminolevulinic acid hydrochloride; HPLC; octanesulfonic acid sodium salt solution; impurity

2016-05-18.

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D201031，ZD201613)；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)優(yōu)秀碩士生導(dǎo)師基金；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)于維漢院士杰出青年培養(yǎng)基金；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(YJSCX2015-60HYD)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(UNPYSCT-2015036)

李海春(1989- )，女，碩士，研究方向：腦靶向系統(tǒng)研究.

彭海生(1975- )，男, 教授, 研究方向：腦靶向系統(tǒng)研究.

TQ463

A

1672-0946(2016)04-0429-04