蓬子菜中香葉木苷抗血栓作用研究

隋文霞，董　坤，萬(wàn)曉晨，寇韓旭，馬英麗

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036)

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蓬子菜中香葉木苷抗血栓作用研究

隋文霞1，董坤2，萬(wàn)曉晨1，寇韓旭1，馬英麗1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036)

為研究蓬子菜活性成分香葉木苷改善血液流變學(xué)異常和抗靜脈血栓作用，通過(guò)結(jié)扎大鼠下腔靜脈造成下肢靜脈血栓模型，通過(guò)檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)，以及觀察下腔靜脈在透射電鏡下的組織學(xué)變化，考察香葉木苷對(duì)血栓大鼠血液流變學(xué)和內(nèi)皮功能的影響.結(jié)果表明，與模型組相比，蓬子菜中香葉木苷能明顯改善血栓大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，并可有效改善下腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能.蓬子菜活性成分香葉木苷具有改善血液流變學(xué)異常和抗靜脈血栓形成的作用.

蓬子菜；香葉木苷；靜脈血栓；血液流變學(xué)

蓬子菜(Galium verum L.)，是茜草科(Rubiaceae)拉拉藤屬(Galium)藥用植物蓬子菜的干燥全草[1].蓬子菜在民間擁有廣泛的藥用基礎(chǔ)，常被用于治療靜脈系統(tǒng)疾病，并已取得良好的臨床療效[2].蓬子菜主要含黃酮類成分，包括香葉木苷(Diosmin)、喇叭茶苷(Palustroside)、蕓香苷(Rutin)等.據(jù)研究表明，香葉木苷(Diosmin，3′，5，7-三羥基4′-甲氧基黃酮-7-蕓香苷)是蓬子菜治療靜脈系統(tǒng)疾病的主要活性成分，能防止靜脈血管壁損傷，可降低靜脈通透性，增加靜脈張力，改善微循環(huán)，抗靜脈血栓形成[3].本實(shí)驗(yàn)以香葉木苷藥理作用為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)血栓大鼠血流變參數(shù)的測(cè)定，觀察其對(duì)血液流變學(xué)的影響，證明香葉木苷具有降低血液黏度，抑制紅細(xì)胞聚集，抑制血栓形成的作用；同時(shí)，應(yīng)用透射電鏡觀察靜脈血管組織形態(tài)學(xué)變化，證明香葉木苷可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而發(fā)揮抗靜脈血栓形成的作用.

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體重200～300g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SCXK2009-0002).

1.2藥品與試劑

香葉木苷(C28H32O15)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%( HPLC)，本實(shí)驗(yàn)室自提阿司匹林片(濟(jì)南永寧制藥股份有限公司)，水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司).

1.3儀器

全自動(dòng)血液流變測(cè)試儀(Z30，南京志倫科技有限公司)，全自動(dòng)血沉儀(Roller20，北京現(xiàn)代威士達(dá)醫(yī)療器械有限公司)，離心機(jī)(KDC-160HR，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，切片機(jī)(LEICAULTRACUTUCT德國(guó))，透射電鏡(TECNAIG荷蘭).

2　方法

2.1分組與給藥

Wistar大鼠，雄性，平均體重250g，隨機(jī)分成6組，每組10只.給藥劑量參考陳奇主編《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》[4]，根據(jù)人的臨床給藥劑量進(jìn)行換算.分別為：空白組、模型組，灌胃生理鹽水；香葉木苷低劑量組：45mg/kg/d；香葉木苷中劑量組：90mg/kg/d；香葉木苷高劑量組：180mg/kg/d；阿司匹林組：15mg/kg/d.均采用灌胃給藥，每日一次，按劑量連續(xù)給藥7 d.

2.2造模方法

用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥位固定，根據(jù)Reyers[5]法，于腹中線劍突下方切開(kāi)皮膚3 cm，剖開(kāi)腹腔，將腸管移出體外，以浸滿生理鹽水的紗布覆蓋腸管.找出下腔靜脈，仔細(xì)分離下腔靜脈主干和左腎靜脈匯合處，用非吸收性絲線結(jié)扎下腔靜脈主干，將腸管移回腹腔內(nèi)，并依次縫合腹壁及皮膚.術(shù)后將大鼠放入籠中單獨(dú)飼養(yǎng).取材前12 h禁食不禁水.

2.3取材方法

2.3.1取靜脈血

將麻醉后的大鼠仰位固定，剖開(kāi)縫合處腹腔及腹膜，找到下腔靜脈，在結(jié)扎線上方血管充盈處采集靜脈血4 mL.并觀察血管內(nèi)是否有血栓形成.

2.3.2取靜脈血管

仔細(xì)分離下腔動(dòng)、靜脈血管，剝離靜脈血管.剝離干凈后，用止血鉗夾住結(jié)扎線上方血管，取血管約2cm，用生理鹽水進(jìn)行沖洗.將所取靜脈截下適當(dāng)長(zhǎng)度，放入2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行固定.

2.3.3制備透射電鏡切片

按取材—漂洗(生理鹽水)—前固定(2.5%戊二醛，4 ℃冰箱2 h以上)—漂洗(0.1 mol/L磷酸緩沖液洗3次，共45 min)—后固定(1%鋨酸1 h左右)—漂洗(0.1 mol/L磷酸緩沖液洗3次，共45 min)—梯度脫水—滲透—包埋—聚合—修塊—切片—載網(wǎng)—染色(飽和醋酸鈾染色30 min，枸櫞酸鉛染色5～8 min)順序制備透射電鏡切片.

2.4檢測(cè)方法

2.4.1血流變指標(biāo)檢測(cè)

將處理后的樣本放入血液流變測(cè)試儀、全自動(dòng)血沉儀檢測(cè)全血粘度、血漿粘度及血沉等.

2.4.2電鏡組織學(xué)觀察

用透射電鏡對(duì)各組靜脈樣品切片進(jìn)行觀察并攝片.

3　統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±S)表示，采用SPSS19.0 for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件分析處理.P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著性差異.

4　結(jié)果

4.1蓬子菜中香葉木苷對(duì)血液流變學(xué)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1、2.模型組血流變參數(shù)均發(fā)生顯著性變化，證明造模成功.而香葉木苷各組均能不同程度降低全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、血沉及紅細(xì)胞聚集和變形指數(shù)，能有效改善血瘀模型大鼠血液流變學(xué)，抑制血細(xì)胞聚集.

表1　香葉木苷對(duì)全血黏度及血漿黏度的影響±S)

注：與模型組比較：**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較：△△P<0.01，△P<0.05

表2　香葉木苷對(duì)紅細(xì)胞壓積、血沉及紅細(xì)胞聚集指數(shù)的影響±S)

注：與模型組比較：**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較：△△P<0.01，△P<0.05

4.2電鏡組織學(xué)觀察結(jié)果

空白組：見(jiàn)圖1，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體輪廓清晰，嵴結(jié)構(gòu)完整并可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，同時(shí)可見(jiàn)正常結(jié)締組織.模型組：見(jiàn)圖2，內(nèi)皮外可見(jiàn)血栓，內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脫失、融合，尚未脫落的內(nèi)皮細(xì)胞膜系結(jié)構(gòu)不清晰，核周隙由于細(xì)胞核縮小而變寬；線粒體空泡變性、腫脹、嵴消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆粒.

香葉木苷低劑量組：見(jiàn)圖3，內(nèi)皮細(xì)胞較連續(xù)，線粒體膜結(jié)構(gòu)不清晰，嵴斷裂，呈空泡狀，胞漿內(nèi)可見(jiàn)體積較小的新生線粒體，溶酶體增多.

香葉木苷中劑量組：見(jiàn)圖4，管腔內(nèi)無(wú)血栓，內(nèi)皮細(xì)胞較連續(xù)，損傷情況減輕，沒(méi)有明顯的脫失；線粒體核膜完整，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)較清晰，有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體.

香葉木苷高劑量組：見(jiàn)圖5，血管腔內(nèi)無(wú)血栓，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，線粒體輪廓清晰，膜完整可見(jiàn)，未見(jiàn)空泡狀.

阿司匹林組：見(jiàn)圖6，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，結(jié)締組織正常，核膜曲度較模型組減小，管腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，線粒體膜較完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，有吞云小泡.

圖1　空白組

圖2　模型組

圖3　香葉木苷低劑量組

圖4　香葉木苷中劑量組

圖5香葉木苷高劑量組

圖6　阿司匹林組

5　討　論

靜脈血流瘀滯、高凝狀態(tài)和靜脈壁損傷是下肢靜脈血栓形成的三大主要原因[6]，所以應(yīng)從改善血流緩滯及高凝狀態(tài)，降低靜脈壁損傷程度和保護(hù)靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等方面對(duì)靜脈血栓疾病進(jìn)行預(yù)防和治療.本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎下腔靜脈的方法進(jìn)行造模，造模成功后可引起局部血流瘀滯，同時(shí)造模所導(dǎo)致的炎癥和缺氧狀態(tài)可引起血管內(nèi)皮損傷，影響其抗血栓和促纖溶作用，促進(jìn)血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成[7].

在正常情況下，機(jī)體的凝血與抗凝血功能是動(dòng)態(tài)平衡的，在維持平衡的過(guò)程中，血液流變學(xué)起到重要作用[8].由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，香葉木苷可有效改善血栓大鼠血液流變學(xué)異常，通過(guò)改善血液的流動(dòng)性、變形性、凝固性防治血栓形成.

通過(guò)進(jìn)行電鏡組織學(xué)觀察，可表明香葉木苷各劑量組均能改善血管內(nèi)皮功能，具有抗靜脈血栓形成作用.同時(shí)，香葉木苷高劑量組血管腔內(nèi)無(wú)血栓，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)較完整連續(xù)，線粒體輪廓清晰，膜完整可見(jiàn)，未見(jiàn)空泡狀，其作用優(yōu)于低、中劑量組，與血液流變學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致.

[1]馬英麗,盧衛(wèi)紅, 崔明宇, 等.蓬子菜藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2006,37(11):1723-1726.

[2]高杰,趙鋼,李令根, 等. 康脈2號(hào)膠囊治療下肢深靜脈血栓形成98例[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(3):259-260.

[3]蘇秀麗.香葉木苷調(diào)控血栓靶蛋白的研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué),2012.

[4]陳奇.藥理試驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006. 1168-1170.

[5]REYERS I, MUSSONI L, KONATIi MB,etal. Failure of aspirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J]. Thromb Res,1980, 18(5): 669-674.

[6]RUTHERFORD R B,RUTHERFORD M D. Vascular Surgery[M].5th ed.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002,192058.

[7]GERRYA F, DAHLBACKB. Factor V and thrombotic disease: description of a Janus faced protein [J]. Arterioscler Thromb Vascbiol, 2009, 22 (4): 530-538.

[8]CRISTINA W, SEBASTIN P F, Leonardo ML,etal. Central nervous system depressant action of flavonoid glycosides[J].European Journal of Pharmacology, 2006,539(3):168-176.

Study on influence of resisting phlebothrombosis of Diosmin abstracted from Galium verum L.

SUI Wen-xia1, DONG Kun2, WAN Xiao-chen1, KOU Han-xu1, MA Ying-li1

(1.School of Pharmacy,Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences, Harbin 150036,China)

To study the influence of diosmin which is one active component abstracted fromGalium verum L. on blood rheology abnormality and the effect of resisting phlebothrombosis of rats’ models, deligation of inferior vena cavawas applied to make rats’ models of phlebothrombosis of lower extremity.A study was performed onthe influence that how diosmin ameliorated the hemorheology by assaying the indexes of blood rheology including whole blood viscosity,blood plasma viscosity, hematocrit, blood sedimentation,index of red blood cell deformation and index of erythrocyte aggregation.In the meantime,made an observation of the changes of inferior vena cave histology under a transmission electron microscope.Results indicated that compared with the model group,diosmin could improve the indexes of hemorheology obviously.It also could protect the endothelial cell functions of inferior vena cava.Diosmin can improve the abnormality of hemorheology,and further,it processes the property of resisting phlebothrombosis.

Galium verum L;diosmin;phlebothrombosis;hemorheology

2015-09-16.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201281274034)；教育部博士點(diǎn)博導(dǎo)類基金資助項(xiàng)目(20112327110006)

隋文霞(1988-)，女，研究方向：中藥活性成分的機(jī)理研究.

馬英麗(1954-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分的機(jī)理研究.

R285

A

1672-0946(2016)04-0390-05