馬鈴薯X病毒熒光定量PCR檢測體系的建立及應(yīng)用

尚曉楠,　吳蓓蕾

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京　100193)

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馬鈴薯X病毒熒光定量PCR檢測體系的建立及應(yīng)用

尚曉楠,吳蓓蕾*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京100193)

馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)是危害茄科作物的一種重要病毒,為了建立特異性檢測PVX的實時熒光定量PCR體系,本研究以PVX-1985分離物中外殼蛋白(coatprotein,CP)基因序列為模板,設(shè)計引物構(gòu)建重組質(zhì)粒并選擇擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的引物成功構(gòu)建出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用建立的體系,成功檢測到以含pCaPVX440侵染性克隆載體的農(nóng)桿菌C58C1接種后的本氏煙(Nicotiana benthamiana)中PVX病毒RNA的拷貝數(shù)。

馬鈴薯X病毒;熒光定量PCR;本氏煙

馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)屬于甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)[1],主要侵染茄科作物,如馬鈴薯、煙草和番茄等。PVX主要通過汁液摩擦傳播[2],單獨侵染引起癥狀較輕,而與馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、馬鈴薯S病毒(Potato virus S,PVS)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)和煙草脈斑病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV)等馬鈴薯Y病毒屬成員復(fù)合侵染時造成更嚴(yán)重的危害[35]。目前,用于檢測PVX病毒的方法主要有血清學(xué)檢測[68]、生物學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測如核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)技術(shù)和實時熒光定量PCR(real-timefluorescentquantitativePCR)技術(shù)等[910]。與實時熒光定量PCR技術(shù)相比,其他方法都存在耗時長、靈敏度低和不能對病毒進(jìn)行定量檢測等缺點。實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高,同時可以對樣本進(jìn)行實時快速定量檢測等優(yōu)點[11]。本研究建立了PVX實時熒光定量PCR檢測體系,有助于檢測以侵染性克隆為基礎(chǔ)的PVX在單一寄主或多個寄主中連續(xù)接種多代后病毒RNA拷貝數(shù)的變化趨勢,從而有助于分析以侵染性克隆為基礎(chǔ)的PVX在單一寄主或多寄主侵染循環(huán)中的進(jìn)化特點。另一方面,為監(jiān)測預(yù)警PVX引起的病害提供技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料:質(zhì)粒pCaPVX440含有完整PVX外殼蛋白(coatprotein,CP)基因,來自PVX-1985分離物,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李向東教授饋贈,用于構(gòu)建實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品,同時由本實驗室轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)中持續(xù)活化保存;本氏煙(Nicotiana benthamiana)由本實驗室長期種植保存,經(jīng)含質(zhì)粒pCaPVX440的農(nóng)桿菌C58C1接種后,用于驗證所構(gòu)建體系的可行性。

供試試劑:Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem和pGEM-TEasy試劑盒購于Promega公司;感受態(tài)Trans 109 E. coli購于Transgene公司;AxyPrepPlasmidMiniprepKit購于Axygen公司;SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(SYBRGreen)和FastQuantRTKit(withgDase)購自天根生化科技有限公司;TRIzol購于Invitrogen公司;TaKaRaTaqTM,dNTPs,10×PCRbuffer(Mg2+plus),DL2000DNAmarker,DL500DNAmarker購自TaKaRa公司。

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中的PVX-1985分離物中PVXCP基因的序列(登錄號:EU571480),集合世界已公布的63個PVX-cp基因,利用MEGA5.0分析該分離物CP核酸序列與NCBI中PVX其他分離物的CP序列的相似性,結(jié)果顯示與亞洲、澳洲、部分歐洲分離物的核酸序列相似性為94.1%～100%,與美洲、部分歐洲分離物的核酸相似性為74.7%～76.1%。利用PrimerPremier3.0軟件設(shè)計引物PVX-F和PVX-R,用于普通PCR檢測。同時,設(shè)計1對用于構(gòu)建陽性質(zhì)粒(實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品)的引物BZP5和BZP3,在2個引物之間設(shè)計引物PVX-F1與PVX-R1用于熒光定量檢測PVX。引物均由上海生工生物工程(股份)有限公司合成。引物序列和擴(kuò)增片段長度見表1。

1.3實時熒光定量方法的建立

1.3.1PVX片段的克隆和測序及重組質(zhì)粒制備

以pCaPVX440質(zhì)粒為模板,BZP5和BZP3為引物,擴(kuò)增PVX部分片段。目的片段長度為653bp。在梯度PCR儀(Eppendorf)上設(shè)定程序為:94℃ 5min;94℃ 45s, 62℃ 90s, 72℃ 90s,30個循環(huán);最后72℃ 10min。經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后利用Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem(Promega)試劑盒回收PCR產(chǎn)物并與pGEM-TEasy(Promega)載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Trans 109 E. coli(Transgene),經(jīng)測序確定陽性克隆,用AxyPrepPlasmidMiniprepKit(Axygen)提取陽性重組質(zhì)粒。

表1　檢測PVX的引物1)

1)F:上游引物;R:下游引物。

F:Forwardprimer;R:Reverseprimer.

1.3.2PVX 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

經(jīng)NanoDrop-2000分光光度計測定,陽性質(zhì)粒濃度為140ng/μL,該重組質(zhì)粒的大小為3 668bp,根據(jù)公式:A=(B×6.022×1023)/(C×650×109)[其中A為拷貝數(shù)/μL,B為質(zhì)粒濃度,C為重組質(zhì)粒長度]計算出拷貝數(shù)為3.54×1010/μL,將計算出的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成2×108拷貝/3μL,再進(jìn)行10倍梯度稀釋,得到2×104～2×108拷貝/3μL的重組質(zhì)粒,保存在-70℃,作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。

以2×104～2×108拷貝/3μL的重組質(zhì)粒DNA為模板,利用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(SYBRGreen)試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng),共5個梯度,每個梯度3個重復(fù)。以RNase-free超純水為空白對照?？偡磻?yīng)體系20μL:DNA/cDNA模板3μL,正向引物(10μmol/L)0.6μL,反向引物(10μmol/L)0.6μL,2×SuperRealPremixPlus10μL,50×ROXReferenceDye0.4μL,RNase-free超純水 5.4μL。體系配好之后在7500RealTimePCR儀器(AppliedBiosystems)上運行。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15min; 95℃ 10s,60℃ 32s,72℃ 32s,40個循環(huán);之后進(jìn)入溶解曲線階段95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 30s,60℃ 15s。反應(yīng)結(jié)束后,系統(tǒng)會自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(slope)和引物的擴(kuò)增效率。Efficiency(%)=(10(-1/slope)-1)×100。

1.4利用實時熒光定量PCR體系定量檢測本氏煙草中的PVX的 RNA拷貝數(shù)

用懸浮溶液(10mmol/LMgCl2,10mmol/LMES(pH=5.6),0.1mmol/L乙酰丁香酮)懸浮含pCaPVX440侵染性克隆載體的農(nóng)桿菌C58C1菌體,調(diào)整濃度使其A600為0.5左右,28℃靜置3h。選取本氏煙植株(5～6周齡)的第4～6片真葉,取不含針頭的5mL一次性注射器吸取菌液進(jìn)行注射接種15株本氏煙(N. benthamiana)[12],同時,吸取懸浮液進(jìn)行注射作為陰性對照,觀察植株發(fā)病癥狀,采集發(fā)病癥狀明顯的植株、健康植株和陰性對照植株提取RNA(參照TRIzol試劑的說明書)。提取的RNA用1%瓊脂糖電泳檢測其完整性,NanoDrop-2000分光光度計檢測其純度。

利用FastQuantRTKit(withgDase)反轉(zhuǎn)錄1μgRNA得到cDNA第一條鏈。以PVX-F1與PVX-R1為引物,以2×104～2×108拷貝/3μL的重組質(zhì)粒DNA為模板,利用建立的PVX實時熒光定量PCR體系定量檢測本氏煙草中的PVX的RNA拷貝數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1PVX片段的克隆和重組質(zhì)粒測序

以pCaPVX440質(zhì)粒為模板,BZP5和BZP3為引物擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,特異的擴(kuò)增片段約為653bp(圖1a)。回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Trans 109 E. coli,PCR檢測得到陽性克隆(圖1b),最終選取4個陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定插入序列,通過VectorNT10.0軟件將測序結(jié)果與PVX-1985分離物CP序列(EU571480)比對,序列一致性達(dá)到100%,說明PVXCP基因的部分片段已經(jīng)成功插入克隆載體。選取質(zhì)粒濃度為140ng/μL,A260/A280為1.80的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

2.2PVX實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以2×104～2×108拷貝/3μL的重組質(zhì)粒為模板,采用引物PVX-F1與PVX-R1擴(kuò)增,每個模板3個重復(fù),建立PVX熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2a為建立的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,擴(kuò)增效率為109.39%,決定系數(shù)R2為0.999,Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)之間存在很好的線性關(guān)系。圖2b是2%瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR的產(chǎn)物,目的條帶單一,即引物擴(kuò)增特異性好。

圖1　重組質(zhì)粒的檢測結(jié)果Fig.1　Detection of the recombinant plasmid

圖2　PVX熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.2　Establishment of the real time quantitative PCR standard curve of PVX

2.3PVX實時熒光定量PCR定量方法的應(yīng)用

2.3.1經(jīng)農(nóng)桿菌接種的本氏煙中PVX的普通RT-PCR檢測

接種14d后,在本氏煙植株頂端葉片出現(xiàn)花葉癥狀,如圖3a。選取發(fā)病癥狀明顯的植株6株、健康植株和陰性對照植株共計8株提取RNA,圖3b為經(jīng)農(nóng)桿菌接種的本氏煙RNA電泳圖。供試的每個樣品的RNA均為3條帶即28S、18S和5S,說明RNA完整性很好。利用FastQuantRTKit反轉(zhuǎn)錄1μgRNA得到cDNA第一條鏈。以cDNA為模板,使用引物PVX-F和PVX-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果見圖3c。由圖可知,每株發(fā)病植株均檢測到PVX。

圖3　經(jīng)農(nóng)桿菌接種的本氏煙中PVX的普通RT-PCR檢測Fig.3　Detection of PVX in Nicotiana benthamiana inoculated by Agrobacterium by RT-PCR

2.3.2檢測發(fā)病本氏煙中PVX的RNA拷貝數(shù)

以拷貝數(shù)為2×104～2×108的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和6株發(fā)病明顯植株的cDNA為模板,使用引物PVX-F1與PVX-R1,在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR。系統(tǒng)會自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算出每個待測樣品(RNA含量為1μg)中PVX的RNA拷貝數(shù)(表2),擴(kuò)增效率為106.359%,決定系數(shù)R2為0.999,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-3.178x+34.848。由表中數(shù)據(jù)看出,每個樣品都落在了標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

表2　RNA含量為1 μg時本氏煙中PVX的RNA拷貝數(shù)

3　討論

目前已有超過40種病毒可以侵染馬鈴薯,其中危害嚴(yán)重而且常見的主要有PVX、PVS、PVY、PLRV等[13]。檢測PVX的分子生物學(xué)技術(shù)大多為RT-PCR[9]和核酸斑點雜交(nucleicacidspothybridization,NASH)[14]等。這些方法只是定性檢測PVX,而且存在假陽性現(xiàn)象,為了可以定量檢測PVX,本試驗以PVXCP基因保守區(qū)域序列設(shè)計引物,建立了熒光定量PCR體系。由于PVX-1985與亞洲、澳洲、部分歐洲分離物的核酸序列相似性為94.1%～100%,該方法可以實時、高靈敏度地檢測樣品中病毒RNA的拷貝數(shù), 并對我國的樣品具有較為廣泛的適用性。

目前世界上只獲得了17個PVX分離物的基因組全序列,分別來自中國、日本、韓國、伊朗、俄羅斯、英國、荷蘭、南美和阿根廷。其中包含3個中國分離物,PVX-1985 (EU571480)、FX21 (EF423572)和Taiwan(AF272736)。世界上的PVX包含4個株系,集合17個PVX分離物的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)PVX群體分為兩大類群,一個來自歐亞群體,另一個來自美洲群體。它們的寄主分別有馬鈴薯、煙草、千日紅等。PVX-1985的基因組全序列與歐洲和亞洲其他分離物的核苷酸相似性在94.2%以上,氨基酸相似性在97.1%以上,而與美洲分離物的核苷酸相似性為80.2%,氨基酸相似性為90.3%[15]。但以侵染性克隆為基礎(chǔ),該病毒在單個或多個寄主中侵染循環(huán)的進(jìn)化特點仍是研究空白。本試驗建立的PVX實時熒光定量PCR體系可以定量檢測到PVX的RNA拷貝數(shù),為研究該病毒在單一寄主或多個寄主侵染循環(huán)中的進(jìn)化特點奠定基礎(chǔ),具有實用價值。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Developmentandapplicationofareal-timequantitativePCRsystemfordetectionofPotato virus X

ShangXiaonan,WuBeilei

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Potato virus X (PVX)isanimportantvirusinfectingmanysolanaceouscrops.Inordertodevelopareal-timequantitativePCRsystemforspecificdetectionofPVX,thestandardcurvewasestablishedsuccessfullybasedontherecombinantplasmidandhighefficientandspecificprimersderivedfromcoatproteingenesequenceofPVX-1985isolate.WesuccessfullydetectedthecopyquantityofRNAfromPVXintheNicotiana benthamianawhichinjectedbytheAgrobacteriumC58C1containingpCaPVX440plasmid.

Potato virus X(PVX);real-timequantitativePCR;Nicotiana benthamiana

20150319

20150514

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(2014)

E-mail:blwu@ippcaas.cn

S432.41;S532

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.029