擬南芥抗鹽突變體的篩選

李超群，王文靜，葛曉春

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海200438)

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擬南芥抗鹽突變體的篩選

李超群1，2，王文靜1，2，葛曉春1，2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海200438)

鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的非生物脅迫因素之一，目前發(fā)現(xiàn)的鹽脅迫信號途徑的基因還非常有限.發(fā)掘新的耐鹽相關(guān)基因?qū)τ诹私庵参锏柠}脅迫響應(yīng)機(jī)制和改善作物的耐鹽性具有非常重要的意義.從EMS突變體庫中篩選突變體是一種經(jīng)典的正向遺傳學(xué)方法，有可能篩選到從T-DNA插入突變體庫中無法發(fā)現(xiàn)的新基因.本實(shí)驗用160mmol/L NaCl作為鹽脅迫的篩選條件，以在含鹽平板上長出綠色子葉作為篩選指標(biāo)篩選抗鹽(Salt Resistant, ST)的EMS突變體，初步篩選到了140株ST突變體，其中84株收到了種子，第二代進(jìn)行抗鹽表型確定后，得到了15株表型穩(wěn)定的ST突變體，均表現(xiàn)出明顯的抗鹽表型，并對其中的一些突變體做了初步的表型及基因定位分析.

擬南芥； EMS誘變； 抗鹽篩選； ST突變體

鹽脅迫是抑制植物生長、降低農(nóng)作物糧食產(chǎn)量的非生物脅迫因素之一[1].海水倒灌、降雨量減少、土壤荒漠化等環(huán)境因素使得全球土地鹽漬化程度日益嚴(yán)重，全球范圍內(nèi)大約有20%的灌溉土地受到不同程度鹽堿化的影響[2].鹽脅迫幾乎影響了植物所有的重要生命過程，如生長發(fā)育、光合作用、蛋白質(zhì)合成、能量和脂類代謝等[3]，因此研究植物如何在鹽脅迫下生存具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義.

植物在受到鹽脅迫后，會伴隨出現(xiàn)離子脅迫、滲透脅迫以及氧化脅迫等.鹽脅迫破壞了植物體內(nèi)的離子平衡，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中有毒性的Na+積累和必需離子(如K+)的減少[4].鹽脅迫下，植物細(xì)胞通過多種Na+轉(zhuǎn)運(yùn)載體限制Na+流入和促進(jìn)Na+排出細(xì)胞，或者將Na+貯存在液泡中.

SOS(Salt Overly Sensitivity)途徑是植物應(yīng)對鹽脅迫信號途徑中非常重要的一條通路，這條途徑中的主要基因都是由篩選鹽敏感突變體發(fā)現(xiàn)的，包括SOS1, SOS2, SOS3, AKT1, HKT1等.SOS1是一種細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+antiporter)[5-6]，可以將細(xì)胞質(zhì)中的 Na+外排出去；SOS2是一種Ser/Thr蛋白激酶，其C末端是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，N末端是催化結(jié)構(gòu)域[7]，它可結(jié)合SOS3，通過磷酸化調(diào)控SOS1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性；SOS3是一種鈣離子結(jié)合蛋白，能夠特異地感知鹽脅迫誘導(dǎo)的鈣離子信號[8-9]，與SOS2形成復(fù)合體，傳遞鹽脅迫信號.當(dāng)植物受到鹽脅迫時，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，SOS3結(jié)合鈣離子使SOS2-SOS3蛋白激酶復(fù)合體磷酸化，激活SOS1的活性，從而將Na+運(yùn)出細(xì)胞.SOS2-SOS3蛋白激酶復(fù)合體還能下調(diào)高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HKT1)的活性，限制Na+流入細(xì)胞[10-13].因此，植物主要通過SOS途徑調(diào)控離子平衡.

鹽脅迫引起的滲透脅迫途徑主要包括了ABA依賴和ABA非依賴途徑.這些途徑中的基因也主要通過對突變體表型分析獲得.NAC(HD-ZIP)和DREB2轉(zhuǎn)錄因子主要參與ABA非依賴信號途徑；而ABRE/ABF(bZIP)，NAC(RD26)，MYB2和MYC2轉(zhuǎn)錄因子主要參與ABA依賴信號途徑.另外，磷脂信號途徑和蛋白激酶信號途徑也會參與到調(diào)節(jié)滲透脅迫的過程中，磷脂酶C(PLC)和D(PLD)水解膜磷脂產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)、二?；视?DAG)和磷脂酸(PA)等第二信使，參與滲透平衡的調(diào)節(jié)；鈣離子依賴的蛋白激酶(CDPK)和MAP激酶通過蛋白激酶信號途徑調(diào)節(jié)滲透平衡[14-16].

擬南芥的生活周期短、子代數(shù)量眾多、基因組簡單且基因組序列已進(jìn)行了測定，這些優(yōu)點(diǎn)使得它成為植物學(xué)研究的模式生物.化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙脂(EMS)是一種烷化劑，可以誘發(fā)植物基因組發(fā)生點(diǎn)突變.與T-DNA插入突變不一樣的是，它可能會產(chǎn)生一些基因功能局部受影響的弱突變體；而T-DNA插入突變則是由于T-DNA大段插入引起基因功能全部或局部喪失，或者表達(dá)水平嚴(yán)重下降引起的突變.EMS突變體中的局部氨基酸變化產(chǎn)生的表型，可以彌補(bǔ)T-DNA插入突變體表型研究的不足.用EMS處理擬南芥種子，構(gòu)建突變體庫是分離和研究基因功能非常有效的方法.

為了篩選抗鹽途徑相關(guān)的新基因，從而為植物抗鹽機(jī)理提供更多信息，本研究利用EMS處理野生型擬南芥(Col-0)種子，構(gòu)建了突變體庫，然后以160mmol/L NaCl作為篩選濃度篩選抗鹽突變體，以能長出綠色子葉作為篩選指標(biāo).我們篩選得到了15株表型穩(wěn)定的抗鹽突變體，并且將這些突變體與Ler的野生型進(jìn)行了雜交，構(gòu)建了圖位克隆的作圖群體.另外，對其中幾個突變體做了遺傳學(xué)分析，檢測了突變基因的顯隱性和是否屬于單基因突變體.

1　材料和方法

1.1材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型，Columbia-0(Col-0)生態(tài)型，Landsberg(Ler)生態(tài)型.

1.2方法

1.2.1實(shí)驗植物材料的種植和生長

用1mL 70% 乙醇旋轉(zhuǎn)滅菌擬南芥種子10min，然后換1mL 無水乙醇+0.01% Triton X-100，振蕩幾次后置于滅菌的干凈濾紙上，待乙醇揮發(fā)后，點(diǎn)播或均勻撒在培養(yǎng)基上.將平板置于4℃冰箱中春化2d，轉(zhuǎn)移至長日照(16h光照/8h黑暗)溫室，(22±2)℃條件下進(jìn)行培養(yǎng).幼苗生長8～9d后移植到土壤中繼續(xù)生長.

1.2.2EMS誘變

稱重1萬粒的野生型(Col-0)種子大約0.2g，置于50mL的離心管中用蒸餾水浸泡6h.離心管離心10min，吸出水(盡量不要吸出種子).向其中加入100mL 的100mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.5)，并加入300μL的EMS，終濃度為0.3%(體積比)，蓋上管蓋.將離心管置于搖床室溫輕輕震蕩12h.處理完后，離心吸除EMS，用蒸餾水清洗10～20次，每次5min.清洗完后，將種子倒入干凈的離心管中，加入0.1% 瓊脂糖懸浮種子，置于4℃低溫處理2d.處理結(jié)束后，直接點(diǎn)種于土壤中，種30～40粒于每個小穴盤(勿太密，否則育性差).生長約2～3周后，觀察土壤中有一些白化苗，說明誘變比較成功.

1.2.3候選突變體的篩選

為了篩選抗鹽突變體，預(yù)實(shí)驗中選擇的NaCl濃度為160mmol/L，將M1代種子(種子誘變后長成的植株結(jié)的種子)以小組為單位均勻地撒種于含160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，移入溫室生長.觀察每個培養(yǎng)基上長出來的有綠色子葉的幼苗，做上標(biāo)記，10d后移植到土中，觀察生長表型，單株收種.再將這些單株收的種子(M2)再次點(diǎn)在含有160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，觀察是否能重復(fù)M1代表型.

1.2.4擬南芥的雜交

取生長狀況良好的擬南芥，從母本植物上挑選未開花的花苞(以白色花瓣剛剛顯露為宜)，于前一天晚上用尖頭鑷子去除雄蕊(4+2)，注意盡量不要傷害到柱頭.第二天10：00～14：00花開最旺盛時取父本的花粉，反復(fù)涂抹于母本的柱頭上，確?；ǚ劢佑|到母本的柱頭，若柱頭第二天變?yōu)樽仙珓t說明授粉成功，等種子成熟即可采收，得到雜交F1代種子.F1可用于觀察突變基因的顯隱性，F(xiàn)2代可統(tǒng)計分離比，判斷是否為單基因突變引起的表型.

得到單基因隱性突變體的純合子后，將其與野生型(Col-0)回交，同時將準(zhǔn)備進(jìn)行圖位克隆的候選個體與另一種生態(tài)型(Ler)擬南芥雜交，得到F1代種子后讓其自交，從F2代群體中選取有表型的個體進(jìn)行突變體基因定位.

1.2.5植物基因組DNA的提取

取2片葉片，加液氮研磨后加入400μL DNA抽提緩沖液(200mmol/L Tris pH 7.5，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5% SDS)，離心5min，取上清，加入等體積異丙醇顛倒振蕩，靜置后離心沉淀DNA，用75%酒精清洗沉淀2次，干燥后加100μL滅菌水溶解.

1.2.6粗定位

從突變體和Ler雜交得到的分離群體F2中，篩選有抗鹽表型的株系，然后取其葉片，提取DNA，利用SSLP分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)表型與標(biāo)記的連鎖關(guān)系來分析突變基因的定位.本文中用的SSLP分子標(biāo)記可以參見文獻(xiàn)[17].

2　結(jié)果與分析

2.1篩選擬南芥抗鹽突變體的鹽濃度確定

據(jù)已有報道，擬南芥Col-0在75mmol/L NaCl的鹽脅迫下表現(xiàn)出鹽敏感表型，在100mmol/L NaCl或者更高的鹽濃度脅迫下，幼苗生長受到嚴(yán)重抑制[18].通過比較不同鹽濃度下擬南芥的生長表型，我們確定了抗鹽突變體的篩選條件為 160mmol/L NaCl.將野生型(Col-0)和EMS突變體種子撒播在同一個1/2 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含160mmol/L NaCl，7d后幼苗的生長狀況如 圖1.由圖1可見，野生型(Col-0)在含 160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，大部分種子都可以萌發(fā)，但是不能長出綠色子葉，而抗鹽的EMS突變體可以長出綠色子葉(圓圈標(biāo)記).

2.2抗鹽突變體的篩選

2.2.1初篩結(jié)果

將EMS突變體M1代種子分成7組，然后，把這些M1代的種子分批撒在含160mmol/L NaCl的 1/2 MS 培養(yǎng)基上，此時野生型子葉全部呈黃色，而抗鹽突變體可以在鹽平板上長出綠色子葉.通過這種方法，初步篩選得到了140株耐鹽ST突變體，將這些突變體幼苗移到土里繼續(xù)生長，最后有84株長大并且收獲了突變體種子M2，將它們命名為ST-1～ST-84.

2.2.2表型重復(fù)的結(jié)果

將84個(ST-1～ST-84)抗鹽突變體M2單株的種子即M3重新點(diǎn)播在含160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)只有15個ST(ST-1，ST-2，ST-7，ST-10，ST-14，ST-25，ST-27，ST-47，ST-53，ST-58，ST-59，ST-60，ST-61，ST-68，ST-70)突變體具有穩(wěn)定的抗鹽的表型.

2.3抗鹽突變體的抗鹽表型

將經(jīng)過重復(fù)篩選后得到的有穩(wěn)定抗鹽表型的突變體進(jìn)行抗鹽表型分析.首先，將這些突變體種子點(diǎn)播在含160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，溫室生長14d，然后拍照.本文選取了其中3個ST突變體(ST-1，ST-25和ST-70)為例說明它們的抗鹽表型(圖2，見第100頁).

另外，我們還統(tǒng)計了這些突變體在鹽平板上的鮮重，發(fā)現(xiàn)這些ST突變體的鮮重明顯大于野生型(圖3，見第100頁).

在平板上直立生長ST-1和ST-2突變體，培養(yǎng)基中加入150mmol/L 或160mmol/L NaCl，以不加 NaCl的平板作為對照.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ST-1和ST-2突變體在正常條件下的根比野生型短，不同濃度鹽處理后，其根長變化到與野生型差不多(圖4，見第100頁).

對它們的根長和鮮重做了定量統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)處理組中突變體的鮮重明顯大于野生型，且突變體能長出綠色的子葉(圖5，見第100頁).

2.4ST-1的遺傳分析

為了確定ST-1突變體基因的顯隱性關(guān)系及突變體是否為單基因突變體，我們將ST-1與Col-0進(jìn)行回交，得到的F1和F2代種子分別點(diǎn)播在含160mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)回交得到的F1代種子在鹽平板上的表型和Col-0一樣，都長不出綠色子葉，回交得到的F2代種子中篩到了抗鹽的突變體如圖6所示，對F2代中有抗鹽表型的個體和與野生型表型的個體進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示.分離比接近1∶3，說明ST-1是一個隱性單基因突變體.

表1　ST-1的遺傳表型分析

2.5ST-1的圖位克隆

2.5.1作圖群體的構(gòu)建

利用擬南芥另一種生態(tài)型(Ler)與ST-1進(jìn)行了雜交，得到F1代，然后讓F1代的種子進(jìn)行自交得到F2代，收種.將收到的F2代種子同樣用160mmol/L NaCl的篩選條件進(jìn)行篩選.將抗鹽表型明顯的突變體移到土里生長，生長一個月后單株取材，作為進(jìn)行圖位克隆的作圖群體.

2.5.2ST-1的粗定位

根據(jù)5條染色體上不同的粗定位SSLP分子標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增的手段對雜交二代的純合子群體進(jìn)行鑒定.統(tǒng)計用不同SSLP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雜交二代的重組率在F21M12標(biāo)記附近最低(表2)，因此基本確定了ST-1中的突變基因位于1號染色體的F21M12標(biāo)記附近，具體結(jié)果如圖7(見第102頁)所示.由圖可知，其他的染色體上的SSLP分子標(biāo)記作為引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶幾乎都有分離，而只有以F21M12作為引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶幾乎和Col-0一樣，沒有分離，這說明F21M12與突變位點(diǎn)連鎖.

表2　ST-1突變體粗定位時各種SSLP分子標(biāo)記的重組率

3　討　論

構(gòu)建突變體庫是分離和研究基因功能的非常有效的方法.合適的篩選方法和篩選濃度是突變體篩選成功的關(guān)鍵，因此篩選方法和篩選濃度的確定是一個非常重要的問題： NaCl濃度過低起不到區(qū)分野生型和突變體的作用；濃度過高則嚴(yán)重影響突變體的萌發(fā)率.朱健康課題組用50mmol/L NaCl作為篩選濃度，采用彎根實(shí)驗篩選擬南芥EMS突變體庫(Col-0為背景)得到了對鹽脅迫敏感的SOS突變體，進(jìn)而成功地解析了SOS信號途徑[5-6, 19].還有一些研究是用EMS誘變甘薯愈傷組織，然后用200mmol/L NaCl 篩選抗鹽的突變體[20]，也成功地得到了一些突變體.

將EMS突變體種子直接撒播到鹽平板上，觀察能不能長出綠色子葉，這種方法較為直觀和快捷.擬南芥Col-0野生型在160mmol/L NaCl的鹽脅迫下，萌發(fā)率受到的影響不是很大，但不能長出綠色子葉，因此是一個較為合適的篩選濃度.本實(shí)驗中，我們采用160mmol/L NaCl來篩選抗鹽突變體.

本實(shí)驗中篩選的突變體，多為鹽脅迫信號途徑的負(fù)調(diào)控因子，因為基因突變后，抗鹽表型會增強(qiáng)，而朱健康及其他多數(shù)課題組等篩選鹽敏感突變體，多為鹽脅迫信號途徑的正調(diào)控因子.目前對于鹽脅迫途徑的負(fù)調(diào)控因子了解還較少，我們希望通過這種方法，能夠克隆到該途徑一些新的基因.EMS突變一般為隨機(jī)點(diǎn)突變，因此每個實(shí)驗室都有可能會篩到一些不同的突變體.

目前從篩選突變體到定位突變基因變得越來越簡捷，特別是隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展.我們已經(jīng)將一些突變體的突變基因進(jìn)行了初步定位，接下來將會采用深度測序的方法對200株以上的雜交F2代抗鹽突變體的混合樣品進(jìn)行全基因組測序，通過生物信息學(xué)分析Col-0和Ler的SNP在雜交F2代的分離情況，將可以精確獲知突變基因的信息.

鹽脅迫和其他非生物脅迫，例如干旱和氧化脅迫等有著密切的聯(lián)系，它們之間的信號通路存在著交叉，存在一些共同的應(yīng)對脅迫的機(jī)制[21].因此，研究鹽脅迫相關(guān)基因，也有可能對其他非生物脅迫途徑的研究提供參考.

[1]HUANG X. A previously unknown zinc finger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control[J].Genes&Development, 2009,23(15)： 1805-1817.

[2]JOHNSON J M. AnArabidopsismutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress[J].BMCPlantBiology, 2014,14(1)： 162.

[3]KURBAN H. Effect of salinity on growth, photosynthesis and mineral composition in leguminous plant Alhagipseudoalhagi(Bieb.)[J].SoilScienceandPlantNutrition, 1999,45(4)： 851-862.

[4]BINZEL M, RATAJCZAK R. Function of membrane transport systems under salinity： Tonoplast[J].Salinity：EnvironmentPlantsMolecules, 2002： 423-449.

[5]SHI H. TheArabidopsisthalianasalt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+antiporter[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000,97(12)： 6896-6901.

[6]QIU Q. Regulation of SOS1, a plasma membrane Na+/H+exchanger inArabidopsisthaliana, by SOS2 and SOS3[J].ProcNatilAcadSciUSA, 2002,99(12)： 8436-8441.

[7]LIU J. TheArabidopsisthalianaSOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000,97(7)： 3730-3734.

[8]ISHITANI M. SOS3 function in plant salt tolerance requiresN-myristoylation and calcium binding[J].ThePlantCellOnline, 2000,12(9)： 1667-1677.

[10]HALFTER U, ISHITANI M, ZHU J,etal. TheArabidopsisSOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000,97(7)： 3735-3740.

[11]LIU J, ZHU J. A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance[J].Science, 1998,280(5371)： 1943-1945.

[12]ZHU J. Salt and drought stress signal transduction in plants[J].AnnualReviewofPlantBiology, 2002,53： 247.

[13]RUS A. AtHKT1 is a salt tolerance determinant that controls Na+entry into plant roots[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2001,98(24)： 14150-14155.

[14]TAKAHASHI S. Hyperosmotic stress induces a rapid and transient increase in inositol 1, 4, 5-trisphosphate independent of abscisic acid inArabidopsiscell culture[J].PlantandCellPhysiology, 2001,42(2)： 214-222.

[15]MIZOGUCHI T ICHIMURA K, YOSHIDA R, et al. MAP kinase cascades inArabidopsis： Their roles in stress and hormone responses, in MAP kinases in plant signal transduction[J].ResultsProblCellDiffer, 2000,27: 29-38.

[16]SHEEN J. Ca2+-dependent protein kinases and stress signal transduction in plants[J].Science, 1996,274(5294)： 1900-1902.

[17]LUKOWITZ W, GILLMOR C S, SCHEIBLE W,etal. Positional cloning inArabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you[J].PlantPhysiology, 2000,123(3)： 795-806.

[18]MUNNS R, TESTER M. Mechanisms of salinity tolerance[J].AnnuRevPlantBiol, 2008,59： 651-681.

[19]WU S, DING L, ZHU J,etal. SOS1, a genetic locus essential for salt tolerance and potassium acquisition[J].ThePlantCellOnline, 1996,8(4)： 617-627.

[20]LUAN Y. Mutation induced by ethylmethanesulphonate(EMS),invitroscreening for salt tolerance and plant regeneration of sweet potato(IpomoeabatatasL.)[J].PlantCell,TissueandOrganCulture, 2007,88(1)： 77-81.

[21]MAHAJAN S, TUTEJA N. Cold, salinity and drought stresses： An overview[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics, 2005,444(2)： 139-158.

Identification of Arabidopsis Salt-Resistant Mutants

LI Chaoqun1,2, WANG Wenjing1,2, GE Xiaochun1,2

(1. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity，Shanghai200438,China)

Salinity is one of the major abiotic stresses that affects the growth and development of plants. So far very limited salt-resistant genes have been cloned and studied. Identifying new genes involved in salt tolerance are very important for understanding the salt signaling pathway and improving salt tolerance of plants. EMS mutagenesis is a classic method of reverse genetics. It can be used to discover novel salt-resistant genes which may not be identified by screening T-DNA insertion lines. In this study, 160mmol/L NaCl was used to screen for salt-tolerant mutants. The leaves of salt-tolerant mutants were green but that of the wild type plants turned yellow. 140 strains of salt-tolerant mutants were identified initially, however, only 84 of them set seeds. After confirmation of the salt resistant phenotype using T2 generation, 15 strains of stable salt-tolerant mutants(ST mutants) were obtained. Genetic and phenotypic analysis and preliminary mutated gene mapping were done for some of the identified mutants.

Arabidopsis; EMS mutagenesis; salt-resistant screening; ST mutant

0427-7104(2016)01-0097-07

2015-04-07

上海市基礎(chǔ)科研重點(diǎn)項目(12JC1400500)，國家自然科學(xué)基金(31170169)

李超群(1987—)，男，碩士研究生；葛曉春，女，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： xcge@fudan.edu.cn.

Q 943.2

A