檸檬酸磷酸酯鈉鹽的合成研究

王　瀝，譚偉強(qiáng)，戰(zhàn)秀志，夏　巖，唐沂珍

(青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，生物環(huán)保與綠色化工研究中心，山東　青島　266033)

?

檸檬酸磷酸酯鈉鹽的合成研究

王瀝，譚偉強(qiáng)，戰(zhàn)秀志，夏巖，唐沂珍

(青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，生物環(huán)保與綠色化工研究中心，山東青島266033)

檸檬酸磷酸酯(Phosphocitrate，簡(jiǎn)稱PC)是一種含有多羧基的酸，其化學(xué)名稱為3-磷酸酯基丙三羧酸，分子式為C6H9PO10。是存在于哺乳動(dòng)物線粒體中的一種天然活性成分，因其活性高、毒性低、副作用小等特點(diǎn)，成為了近些年來(lái)新藥篩選領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文以檸檬酸和芐醇為起始原料，經(jīng)酯化、水解、加氫還原、堿中和后高收率合成了檸檬酸磷酸酯鈉鹽，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、31P NMR和LC-MS表征。

檸檬酸磷酸酯；檸檬酸；合成

檸檬酸磷酸酯最早提取于人尿液和大鼠肝的線粒體中[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸磷酸酯在體內(nèi)有很強(qiáng)的抗礦化作用，對(duì)草酸鈣和羥基磷灰石晶體的形成和成長(zhǎng)具有一定的抑制作用[3]，能夠抑制鈣離子的沉積，可預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生[4]；另一方面，檸檬酸磷酸酯可抑制晶體誘導(dǎo)沉淀元癌基因的表達(dá)和有絲分裂的發(fā)生[5]，對(duì)羥基磷灰石誘導(dǎo)的金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶、白介素的上調(diào)和有絲分裂也具有一定的抑制作用[6]；此外檸檬酸磷酸酯還具有抑制鳥(niǎo)糞石的結(jié)晶化[7]，抑制鈣鹽形成的活性，這對(duì)工業(yè)廢水的凈化非常有用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸磷酸酯在體內(nèi)濃度4.5 mg/mL以下時(shí)不會(huì)影響細(xì)胞的正常功能，也沒(méi)有發(fā)生任何顯著的副作用[8]，因此，檸檬酸磷酸酯作為一種潛在的藥物，成為近年來(lái)新藥篩選領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1959 年，J. Meyer[9]首次以檸檬酸三乙酯為原料經(jīng)四步反應(yīng)合成了檸檬酸磷酸酯，由于反應(yīng)不完全，以及難分離、低收率、高成本等缺點(diǎn)，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本文研究了以檸檬酸和芐醇為起始原料，經(jīng)兩步酯化、催化還原三步反應(yīng)合成檸檬酸磷酸酯。該合成工藝所需的原料便宜易得，具有生產(chǎn)成本低，操作方便，轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

DRX-400核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司； LTQ XL LC-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo公司。

水合檸檬酸(99.0%)，阿拉丁試劑有限公司；鈀碳(10%Pd)，上海柏卡化學(xué)技術(shù)有限公司；五氯化磷(99.0%)，阿達(dá)瑪斯(Adamas)試劑；苯甲醇(99.0%)，上海柏卡化學(xué)技術(shù)有限公司；其他反應(yīng)試劑均為國(guó)產(chǎn)；反應(yīng)溶劑均為市售分析純。

1.2合成方法

1.2.1檸檬酸三芐酯(2)的合成

在裝有分水器的反應(yīng)瓶中，加入84.0 g (0.40 mol)水合檸檬酸和210 mL苯甲醇(1.98 mol)，油浴160～180 ℃反應(yīng)8 h，減壓蒸餾除去過(guò)量的苯甲醇，剩余粗產(chǎn)物趁熱倒入100 mL無(wú)水乙醇中，快速攪拌下降至常溫后，于-20 ℃繼續(xù)冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，固體用無(wú)水乙醇(150 mL×3)洗，真空干燥后，得149 g白色晶體2，收率為80%。1H NMR (DMSO，400 MHz，23 ℃)，δ：7.31 (m，15 H，C6H5)，5.04 (m，6 H，CH2O)，2.85 (d，4 H，CH2CO)，ESI-MS，m/z：462.1。

1.2.2磷酸檸檬酸二芐酯(3)的合成

在裝有溫度計(jì)、機(jī)械攪拌的三頸瓶中加入30.0 g(65 mmol)檸檬酸三芐酯和30 mL甲苯，冰浴冷卻后逐滴加入13.6 g(65 mmol)五氯化磷的甲苯(100 mL)溶液，繼續(xù)冰浴反應(yīng)1 h后，緩慢滴加5.0 mL去離子水，繼續(xù)冰浴攪拌1 h后，過(guò)濾，固體用甲苯(50 mL×3)洗，真空干燥后得19.5 g白色固體3，收率為66%。1H NMR (DMSO，400 MHz，23 ℃)，δ：7.36 (d，10 H，C6H5)，5.07 (s，4 H，CH2O)，3.29 (s，4 H，CH2CO)，ESI-MS，m/z：453.1。

1.2.3檸檬酸磷酸酯鈉鹽的合成

在三口反應(yīng)瓶中，依次加入10.0 g(22 mmol)磷酸檸檬酸二芐酯、25 mL去離子水和5 mL甲醇，氫氣流洗氣三遍后，加入0.25 g Pd/C(10%Pd)，保持1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的氫氣流持續(xù)反應(yīng)1 h，熱過(guò)濾后，濾液用6.2 mL NaOH(10 mol/L)水溶液調(diào)至pH為7，減壓除水后，加入30 mL無(wú)水乙醇超聲洗滌三次，真空干燥，得8.1 g白色固體為磷酸檸檬酸酯鈉鹽，收率95%。1H NMR (D2O，400 MHz，23 ℃)，δ：3.13 (d，2 H，CH2)，2.76 (d，2 H，CH2)，31P NMR (D2O，162 MHz)δ：-2.14；ESI-MS(M+Na+)：295.0。

2　結(jié)果與討論

2.1PC的合成

到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道的PC化學(xué)合成法主要有五種[10]。第一種方法的第一步反應(yīng)會(huì)有30%未反應(yīng)的檸檬酸三乙酯，難以分離，即使改變溫度、時(shí)間等都不能提高收率[9]。后續(xù)兩步反應(yīng)產(chǎn)物難分離，且分離用Dowex-50-H+價(jià)格昂貴，生成成本較高。第二種方法其合成所用原料及催化劑價(jià)格較高，同樣存在反應(yīng)后處理困難問(wèn)題，難以工業(yè)化生產(chǎn)[2]。第三種方法的合成需要五步反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，產(chǎn)率低，所用離子交換樹(shù)脂用量大，成本較高[11]。第四種和第五種方法類似[12-13]，以檸檬酸三芐酯為原料，苯作為溶劑與五氯化磷在冰浴下反應(yīng)、低收率得到磷酸檸檬酸二芐酯，最后采用鈀碳催化，以水為溶劑得到目標(biāo)產(chǎn)物。反應(yīng)條件模糊，收率較低。

本文實(shí)驗(yàn)中參考第五種合成方法修改，以水合檸檬酸為原料，用苯甲醇經(jīng)酯化反應(yīng)保護(hù)后得到檸檬酸三芐酯，由于三羧基的活性較高，反應(yīng)中無(wú)需加入催化劑，即可以80%的收率得到化合物2。文獻(xiàn)中用檸檬酸三乙酯為原料經(jīng)系列反應(yīng)后，最終產(chǎn)物難以分離，且成本較高；而用苯甲醇作為保護(hù)基后，將會(huì)使得加氫水解反應(yīng)變得非常容易。此外，由于化合物2熔點(diǎn)較低，難結(jié)晶，采用低溫結(jié)晶純化的方法更容易得到高純度的白色晶體(色譜純度98%以上)。

第二步反應(yīng)中，文獻(xiàn)中將檸檬酸三芐酯溶于苯中，低壓真空下加入經(jīng)研磨的固體PCl5粉末，冰浴反應(yīng)后經(jīng)處理，最終磷酸檸檬酸二芐酯產(chǎn)率61%[12]。反應(yīng)中用到的苯毒性較大，且操作過(guò)程不易工業(yè)化生產(chǎn)，反應(yīng)中我們使用干燥的甲苯代替苯作為溶劑，并利用氮?dú)獗Ｗo(hù)避免原料PCl5水解造成的損失，提高反應(yīng)收率的同時(shí)，更適宜工業(yè)化操作。

最后一步反應(yīng)中，文獻(xiàn)中直接用水作為溶劑，鈀/碳常溫常壓催化反應(yīng)7 h以上，再將其做成鈉鹽后，收率可達(dá)100%[13-14]。實(shí)驗(yàn)中我們嘗試?yán)梦墨I(xiàn)中方法，最終得到粘稠狀化合物，經(jīng)洗滌，低溫干燥后，經(jīng)1H NMR和LC-MS分析，產(chǎn)物中有未完全反應(yīng)的原料存在，脫芐效果較差；用甲醇代替水作為溶劑進(jìn)行催化氫化，分析產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)除PC外，還有其甲酯化產(chǎn)物生成，且難以分離。最后以水/甲醇(V:V=5:1)作為溶劑，進(jìn)行常溫常壓催化反應(yīng)1 h后，再經(jīng)氫氧化鈉水溶液中和處理后，得到磷酸檸檬酸酯的鈉鹽。產(chǎn)物經(jīng)1H、31P NMR LC-MS分析，純度較高，該合成工藝操作較方便，收率較高，反應(yīng)時(shí)間較短，較文獻(xiàn)報(bào)道的水體系更適合后處理操作[13]；此外，如果去離子水代替普通水能更好的改善產(chǎn)物的純度。

2.2產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

通過(guò)核磁共振氫譜(圖1)和磷譜對(duì)PC的鈉鹽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，數(shù)據(jù)分析表明其結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)吻合[13-14]，其MS分析結(jié)果也證實(shí)了其結(jié)構(gòu)。

圖1　化合物PC的1H NMR

3　結(jié)　論

通過(guò)文獻(xiàn)方法的改進(jìn)，以檸檬酸和苯甲醇為原料，詳細(xì)考察了三步反應(yīng)條件的優(yōu)化，設(shè)計(jì)了一條原料便宜易得、反應(yīng)條件溫和、操作方便、生產(chǎn)成本低、收率高的適合于工業(yè)化生產(chǎn)的合成路線。產(chǎn)物通過(guò)1H NMR, LC-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

研究中合成的磷酸檸檬酸二乙酯，通過(guò)檸檬酸和苯甲醇為原料，經(jīng)酯化保護(hù)羧基、磷酸酯化反應(yīng)后得到，收率較高；對(duì)磷酸檸檬酸二乙酯的催化脫卞反應(yīng)制備最終產(chǎn)物進(jìn)行了深入研究，確定了最佳的反應(yīng)條件：以水/甲醇(V:V=5:1)為溶劑，Pd/C(10%Pd)作為催化劑，保持氫氣流為1大氣壓，持續(xù)反應(yīng)1 h，經(jīng)氫氧化鈉水溶液中和，減壓除水，再經(jīng)乙醇超聲洗滌，干燥即可以95%以上的收率得到檸檬酸磷酸酯鈉鹽。

[1]Howard J E. Studies on urinary stone formation: a saga of clinical investigation[J]. John Hopkins Med. J, 1976, 139: 239-252.

[2]Tew W P, Malis C D, Howard J, E, et al. Synthesis and characterization of phosphocitric acid, a potent inhibitor of hydroxylapatite crystal growth[J]. Biochemistry, 1980, 19(9): 1983-1988.

[3]Wierzbichi A, Sikes C. S, Sallis J. D, et al. Scanning electron microscopy and molecular modeling of inhibition of calcium oxalate monohydrate crystal growth by citrate and phosphocitrate[J]. Calcified Tissue International, 1995, 56(4): 297-304.

[4]John D S, Konstantinos D D, Herman S C. Phosphocitrate, a potential therapeutic agent for calcium crystal deposition diseases[J]. Current Rheumatology Reviews, 2006, 2(1): 95-99.

[5]Cheung H S. Phosphocitrate as a potential Therapeutic strategy for crystal deposition disease[J]. Current Rheumatology Reports, 2001, 3(1): 24-28.

[6]Cooke M M, McCarthy G M, Sallis J D, et al. Phosphocitrate inhibits calcium hydroxyapatite induced mitogenesis and upregulation of matrix metalloproteinase-1, interleukin-1β and cyclooxygenase-2 mRNA in human breast cancer cell lines[J]. Breast Cancer Research and Treatment, 2003, 79(2): 253-263.

[7]Kofina A N, Demadis K D, Koutsoukos P G. The effect of citrate and phosphocitrate on struvite spontaneous presipitation[J]. Crystal Growth Design, 2007, 7(12): 2705-2712.

[8]Krug H E, Mahowald M L, Halverson P B, et al. Phosphocitrate prevents disease progression in murine progressive ankylosis[J]. Arthritis & Rheumatism, 1993, 36(11): 1603-1611.

[9]Joe M, Roy J B, Ivo J S J. The Synthesis of Citric Acid Phosphate[J]. J. Am. Chem. Soc., 1959, 81(9): 2094-2096.

[10]單燕,余勃,程凱,等.檸檬酸磷酸酯的生物活性和合成方法研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與研究,2013,25(B12):141-147.

[11]Williams G, Sallis J D. The synthesis of unlabeled and 32P-labeled phosphocitrate and analytical systems for its identification[J]. Anal. Biochem, 1980, 102(2): 365-373.

[12]Pankowski A H，Meehan J D, et al. Synthesis via a cyclic dioxatrichlorophosphorane of 1,2-dibenzyl-2-phosphonooxy citrate[J]. Tetrahedron Letters, 1994, 35(6):927-930.

[13]陸豫,余勃,洪挺,等.檸檬酸磷酸酯的合成方法[P].中國(guó),CN101696223A,2010-04-21.

[14]程凱.檸檬酸磷酸酯的理化性質(zhì)研究及其衍生物的合成[D].南昌:南昌大學(xué),2014.

Study on the Synthesis of Phosphocitrate Sodium

WANG Li, TAN Wei-qiang, ZHAN Xiu-zhi, XIA Yan, TANG Yi-zhen

(Qingdao Technological University, School of Environmental and Municipal Engineering,ResearchCenterofEnvironmentalBiologyandGreenChemistry,ShandongQingdao266033,China)

Phosphocritrate (PC) is a naturally organic acid containing three carboxyl named 1,2,3-tricarboxylic acid-2-hydroxyhosphate, its formula for C6H9PO10. It is one of the natural active ingredients existing in mammal’s mitochondria. Recently it becomes the study hot spot in the field of new drug filer because of its high activity, low toxic, fewer side effects and so on. A simple method for the synthesis of phosphocitrate starting from citric acid and benzyl alcohol was described. The structures were characterized by1H NMR,31P NMR and LC-MS.

phosphocitrate; citric acid; synthesis

王瀝(1990-)，女，碩士生，主要研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)及有機(jī)合成。

譚偉強(qiáng)，男，副教授。

O626.2

A

1001-9677(2016)01-0096-03