硫化氫對肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元的影響

黃　蔚　錢靜蓉

?

·基礎(chǔ)研究·

硫化氫對肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元的影響

黃蔚錢靜蓉

肝硬化門脈高壓癥患者常伴有胃動力障礙，表現(xiàn)為胃排空延遲、胃電節(jié)律紊亂、胃動力相關(guān)激素異常等，但目前仍無一致性結(jié)論。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是分布于胃腸道的一種與神經(jīng)密切聯(lián)系的間質(zhì)細(xì)胞，主要參與胃腸道慢波電活動，是胃腸道的起搏細(xì)胞，與肝硬化胃腸動力障礙有關(guān)[1-2]。硫化氫(H2S)被稱為是第三種氣體信號分子，近年來的研究發(fā)現(xiàn)在消化道中也能產(chǎn)生H2S，且對胃動力具有雙重調(diào)節(jié)作用[3]。本研究通過觀察H2S干預(yù)后肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇ICC和神經(jīng)元的變化，以探討H2S對胃動力的影響。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級健康SD大鼠共30只，體質(zhì)量224.60±12.98 g，購于第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心[許可證號SCXK(滬)2013-0016]；硫氫化鈉(NaHS)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(生產(chǎn)批號：20121123)；硫代乙酰胺(TAA)購于常州千杏生物科技有限公司(生產(chǎn)批號：20130125)。SD大鼠飼養(yǎng)于中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所，溫度18℃～22℃，濕度50%左右，按實(shí)驗(yàn)要求提供相應(yīng)飼料，自由進(jìn)食和飲水。

1.2方法

1.2.1動物造模及藥物干預(yù)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組：造模組10只，H2S干預(yù)組10只，正常對照組10只，給予編號、稱重，飼以普通飼料并自由進(jìn)食及飲水。造模組采用TAA制備肝硬化門脈高壓癥大鼠模型方法，制備3% TAA(1.5 g TAA溶于50 mL水中)，隔日每100 g大鼠注射0.33 mL，造模時間為9周[4-5]。H2S干預(yù)組在造模組基礎(chǔ)上每日腹腔注射NaHS(體外實(shí)驗(yàn)H2S的常用供體) 10 μmol · kg-1· d-1，造模時間為9周。正常對照組：常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水及覓食。各組每周稱重并記錄，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)節(jié)藥物用量。

1.2.2胃黏膜大體標(biāo)本制備造模9周后大鼠禁食12 h，飲水，3%戊巴比妥0.1 mL/100 g腹腔內(nèi)麻醉后暴露腹腔取出全胃，以0.9% NaCl溶液沖洗胃內(nèi)容物，剪取胃竇部2 mm×4 mm大小的組織兩塊，其中一塊放入4%多聚甲醛固定石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色。另一塊胃竇組織-80℃保存待用。

1.2.3肝功能及凝血酶原時間測定以Bayer1650全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)含量，Philips IU22全自動凝血分析儀檢測血漿凝血酶原時間(PT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測胃竇組織c-kit蛋白表達(dá)胃竇標(biāo)本放入4%甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋。切片放入二甲苯和乙醇中脫蠟至水，蒸餾水沖洗；EDTA抗原修復(fù)，0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5 min×3次；3% H2O2放入濕盒中室溫避光孵育25 min，0.01 mmol/L PBS洗滌5 min×3次；組化筆在組織周圍畫圈封閉非特異性抗原，3%牛血清白蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，甩干；滴加1∶50 c-kit一抗，4℃過夜，次日0.01 mmol/L PBS洗滌5 min×3次；滴加1∶1二抗，室溫孵育50 min，0.01 mmol/L PBS洗滌5 min×3次；滴加DAB顯色液，室溫避光顯色10 min，水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、樹脂封片，光鏡下先定性觀察，400倍高倍鏡下每張切片挑選3個視野進(jìn)行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算c-kit蛋白的累積光密度(IOD)值。1.2.5免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測胃竇組織膽堿能神經(jīng)元胃竇標(biāo)本以0.01 mmol/L PBS漂洗5min×3次，組化筆在組織周圍畫圈封閉非特異性抗原，3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；滴加1∶100 ChAT一抗，4°C過夜，次日0.01 mmol/L PBS洗滌5 min×3次；滴加1∶400熒光二抗，室溫孵育50 min，0.01 mmol/L PBS洗滌5 min×3次。熒光顯微鏡下觀察，每只大鼠取6張鋪片，在200倍高倍鏡下每張鋪片隨機(jī)取2個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算ChAT陽性神經(jīng)的IOD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1造模情況

H2S干預(yù)組有1只大鼠在第7周死亡，造模組有2只大鼠分別在第6周及第8周死亡，故最終27只大鼠存活，正常對照組10只，H2S干預(yù)組9只，造模組8只。

2.2肝功能和PT測定

造模組ALT和TBiL水平明顯高于正常對照組(P=0.042，P=0.025)，H2S干預(yù)后兩個指標(biāo)都有所下降，但與造模組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.311，P=0.058)。3組間ALB、PT、INR水平相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3胃竇組織c-kit蛋白表達(dá)

光鏡下免疫組織化學(xué)染色顯示c-kit陽性ICC呈棕黃色，位于環(huán)形肌與縱行肌之間，肌間分布較明顯，形狀以圓形、細(xì)長型較多見。模型組胃竇c-kit陽性ICC染色淺，分布少，明顯低于正常對照組(P=0.026)；H2S干預(yù)后胃竇c-kit陽性ICC染色加深，分布明顯增加，與造模組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)。見圖1、表2。

表1　各組大鼠肝功能及凝血酶原時間比較

注：與造模組相比較，aP<0.05

圖1　免疫組織化學(xué)檢測胃竇組織c-kit蛋白表達(dá)情況(×400)　A　H2S干預(yù)組　B　造模組　C　正常對照組

2.4胃竇組織ChAT免疫熒光實(shí)驗(yàn)

免疫熒光染色顯示，ChAT抗體可使膽堿能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維染色，但神經(jīng)元邊界不甚清楚，辨認(rèn)較為困難。與正常對照組相比較，造模組興奮性膽堿能神經(jīng)IOD值明顯降低(P=0.000)，給予H2S干預(yù)后指標(biāo)明顯提高，與造模組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。見圖2、表2。

表2　各組大鼠c-kit蛋白和ChAT陽性神經(jīng)元比較

注：與造模組相比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2　免疫熒光檢測ChAT陽性神經(jīng)元表達(dá)(×200)　A　H2S干預(yù)組　B　造模組　C　正常對照組

3　討論

胃腸道動力是由ICC、平滑肌細(xì)胞和腸神經(jīng)共同調(diào)控的。肝硬化門脈高壓癥患者由于門靜脈壓力升高，出現(xiàn)腹水、脾大和門體側(cè)支循環(huán)形成等一組臨床綜合征，存在明顯胃腸動力障礙，表現(xiàn)為食欲減退、惡心、腹脹等癥狀，導(dǎo)致進(jìn)食減少，加重營養(yǎng)不良的發(fā)生。近年來研究顯示，胃腸道ICC數(shù)量減少及超微結(jié)構(gòu)改變、胃腸道神經(jīng)元病變可能與發(fā)病有關(guān)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇ICC數(shù)量明顯減少，胞漿空泡變性，核周異染色質(zhì)增加，核周間隙增寬[6]。

H2S是一種第三類氣體信號分子，哺乳動物的內(nèi)源性H2S主要以半胱氨酸為底物，由胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)代謝生成。H2S具有舒張血管、降低血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和心肌負(fù)性肌力的多種生物學(xué)效應(yīng)[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，CSE在肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞表達(dá)，星狀細(xì)胞活化時，CSE含量下降，H2S合成減少，對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的抑制降低[9]。H2S可能通過以下途徑參與肝硬化門靜脈高壓的形成：(1)參與調(diào)節(jié)平滑肌舒張；(2)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖；(3)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡[10]。

本課題組前期通過預(yù)防性給予肝硬化門脈高壓癥大鼠NaHS后觀察到，胃竇ICC超微結(jié)構(gòu)明顯改善，細(xì)胞數(shù)量增加[6]，提示H2S可顯著減輕ICC損傷。c-kit是ICC的一種跨膜蛋白，其配體干細(xì)胞因子(SCF)由神經(jīng)元細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，對于促進(jìn)ICC生長、分化和維持ICC正常生理功能具有重要作用，通過標(biāo)記c-kit蛋白能夠間接反映ICC的數(shù)量和密度。本研究結(jié)果顯示H2S干預(yù)組胃竇組織c-kit蛋白表達(dá)較造模組明顯增加，提示H2S對胃竇ICC具有保護(hù)作用。張觀坡等[11]研究認(rèn)為，H2S對缺血再灌注大鼠小腸回縮功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕腸神經(jīng)元尤其是興奮性神經(jīng)元的損傷有關(guān)。免疫熒光結(jié)果亦證實(shí)，與造模組相比較，H2S組肌間神經(jīng)叢興奮性膽堿能神經(jīng)元的IOD值明顯升高，提示H2S對胃竇運(yùn)動功能保護(hù)作用的主要機(jī)制為減輕興奮性神經(jīng)元的損傷。

研究證實(shí)，H2S能促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成，抑制血管基質(zhì)重塑[12]，其機(jī)制有以下幾種可能：(1)促進(jìn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、p38分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化；(2)增加血管平滑肌細(xì)胞中血管內(nèi)皮因子的表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子受體的磷酸化；(3)激活下游蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，直接激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/survivin信號通路；(4)上調(diào)黏附分子(如整合素αvβ3)的表達(dá)。此外，H2S作為一種潛在的舒血管物質(zhì)，通過打開血管平滑肌細(xì)胞上ATP敏感性鉀離子(KATP)通道或電壓依賴性鉀離子通道直接誘導(dǎo)血管舒張[13-14]。由此可見，H2S減輕胃竇ICC和神經(jīng)元損傷是否與其具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能有關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，H2S能夠減輕肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇起搏細(xì)胞ICC的損傷，降低門脈高壓對胃竇神經(jīng)元尤其是興奮性神經(jīng)元的損害，為以H2S為供體的藥物用于臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

1 翁超, 袁琴, 范瑩. Cajal間質(zhì)細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2012, 20: 1848-1852.

2 朱金照, 王艷麗, 呂勇, 等. 肝硬化大鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版), 2010, 4: 278-282.

3 劉穎, 羅和生. 硫化氫與消化道動力的研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué), 2015, 20: 52-54.

4 張誼, 張啟瑜, 廖毅, 等. 硫代乙酰胺劑量個體化誘導(dǎo)大鼠肝硬化門脈高壓模型[J]. 肝膽胰外科雜志, 2007, 19: 164-167.

5 Abraldes JG, Pasarín M, García-Pagán JC. Animal models of

portal hypertension[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12: 6577-6584.

6 錢靜蓉, 黃蔚. 硫化氫對肝硬化門脈高壓癥大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中南藥學(xué), 2015, 13: 609-612.

7 Huang Q, Sparatore A, Del Soldto P, et al. Hydrogen sulfide releasing aspirin, ACS14, attenuates high glucose-induced increased methylglyoxal and oxidative stress in cultured vascular smooth muscle cells[J]. PLoS One, 2014, 9: e97315.

8 Olas B. Hydrogen sulfide in hemostasis: friend or foe[J]. Chem Biol Interact, 2014, 217: 49-56.

9 王慧, 任嬙, 陳衛(wèi)剛, 等. PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在硫化氫影響肝星狀細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原表達(dá)中的作用[J].中華肝臟病雜志, 2014, 22: 430-433.

10 宋麗秀, 鄭勇. 氣體信號分子在肝硬化門靜脈高壓形成中的作用[J]. 世界華人消化雜志, 2009, 17: 1962-1966.

11 張觀坡, 高峻, 李桂香, 等. 硫化氫對大鼠腸缺血再灌注后回腸收縮活性的保護(hù)作用[J]. 胃腸病學(xué), 2012, 17: 119-123.

12 索榮, 姜志勝. 硫化氫與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展, 2012, 33: 54-56.

13 Linden DR. Hydrogen sulfide signaling in the gastrointestinal tract[J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20: 818-830.

14 Li YB, Zhang GZ, Yang XC, et al. Effect of hydrogen sulfide on the KATP current in isolated rat ventricular myocytes[J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2009, 37: 445-448.

(本文編輯：周駿)

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會課題(20124211)

200333上海市利群醫(yī)院消化科

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.014

2015-11-25)