潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道通透性改變與TNF-α及NF-κB P65的關(guān)系*

黃循銣，王承黨，王瑞幸，焦海霞△

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建醫(yī)科大學(xué)消化研究室，福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)系，福州 350004；2.福建醫(yī)科大學(xué)生理及病理生理學(xué)系，福州 350004)

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潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道通透性改變與TNF-α及NF-κB P65的關(guān)系*

黃循銣1，王承黨1，王瑞幸2，焦海霞2△

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建醫(yī)科大學(xué)消化研究室，福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)系，福州 350004；2.福建醫(yī)科大學(xué)生理及病理生理學(xué)系，福州 350004)

目的：采用2.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)定量灌胃誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，觀察小鼠結(jié)腸通透性改變與腫瘤壞死因子α(TNF-α)及NF-κB p65的關(guān)系。方法：48只ICR小鼠隨機(jī)分為2組(n=24)：對(duì)照組和模型組。模型組小鼠給予2.5%DSS定量灌胃誘發(fā)小鼠急性UC，對(duì)照組小鼠予同體積的蒸餾水灌胃代替。記錄兩組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)，9 d后測(cè)定兩組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分、結(jié)腸通透性、TNF-α及NF-κB p65。統(tǒng)計(jì)分析DAI、結(jié)腸通透性、TNF-α與NF-κB p65之間的相關(guān)性。結(jié)果:與對(duì)照組比較，模型組小鼠DAI、結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分、結(jié)腸通透性、TNF-α、NF-κB p65均顯著增高(P均<0.01)。小鼠DAI增高與結(jié)腸通透性密切相關(guān)(P均<0.01)，結(jié)腸通透性增高與TNF-α、NF-κB p65密切相關(guān)(P均<0.01)。結(jié)論：與對(duì)照組小鼠相比，DSS造模小鼠的結(jié)腸通透性顯著增高，并與TNF-α、NF-κB p65增高呈正相關(guān)。TNF-α、NF-κB p65增高導(dǎo)致結(jié)腸通透性增高，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥免疫反應(yīng)過(guò)度增強(qiáng)，可能是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

葡聚糖硫酸鈉；潰瘍性結(jié)腸炎；通透性：NF-κB p65;TNF-α;小鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)近10年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率逐漸增高，逐漸成為消化系統(tǒng)的常見病[1]。該病為一種終身性疾病，以腹痛、腹瀉、血便為特征，反復(fù)發(fā)作，且10年后腸癌發(fā)病率較高，已成為消化內(nèi)科的常見病?，F(xiàn)有研究表明結(jié)腸上皮屏障受損可能是導(dǎo)致UC患者發(fā)病及反復(fù)發(fā)作的重要原因之一[1]，但其具體機(jī)制尚未明了。TNF-α是一種具有多種生物活性的促炎因子。在生理情況下，腸道細(xì)胞自身分泌的和腸道黏膜淋巴細(xì)胞分泌的TNF-α作用于臨近的腸道細(xì)胞，組成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞的增殖和凋亡，對(duì)維持腸道屏障起重要作用；在病理情況下,腸道黏膜中多種炎性細(xì)胞均可大量分泌TNF-α，在UC的發(fā)病中具有重要作用。TNF-α的表達(dá)主要受NF-κB調(diào)控，后者為一類核內(nèi)的炎性轉(zhuǎn)錄因子家族，精密地調(diào)控著炎性反應(yīng)和凋亡信號(hào)[2]。本文采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)定量灌胃誘發(fā)小鼠急性UC模型，測(cè)定小鼠結(jié)腸通透性，并初步探討其與炎癥因子TNF-α和NF-κB p65的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雄性ICR小鼠48只，6～8周齡，體重(25±2)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXX(滬)2012-0002]，實(shí)驗(yàn)在福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(閩)2012-0001]，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。小鼠根據(jù)體重分層隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組，每組24只。

1.2主要試劑

DSS(Mr 36 000～50 000)購(gòu)自美國(guó)ICN公司；伊文思蘭(MW：960.83)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NF-κB p65一抗(濃縮型)購(gòu)自美國(guó)Labvision公司；TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自上海西寶生物有限公司；二步法抗兔免疫組化檢測(cè)試劑盒(Evision +/HRP/Rb)及DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司；N-乙酰半胱氨酸、甲酰胺購(gòu)自廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；糞隱血試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3UC模型建立

模型組小鼠每天分別于10:00、14:00和18:00給予2.5% DSS溶液定量灌胃，DSS溶液每日新鮮配制，每次30 ml/kg，每天末次灌胃后給予足量混合配方顆粒飼料，次日08:00取走飼料。不另外給予飲水，連續(xù)9 d[3]；對(duì)照組小鼠除以等體積的蒸餾水代替2.5%DSS外，余同造模組。

1.4疾病活動(dòng)指數(shù)測(cè)定

每天測(cè)定小鼠體重、觀察大便次數(shù)、性狀和便血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)分值，DAI評(píng)分=體重評(píng)分(0～4)+糞便形態(tài)評(píng)分(0～4)+血便評(píng)分(0～4)。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[4]。

Tab.1　Score of the disease activity indexes(DAI)

Normal feces:Formed feces;Loose feces:Pasty or half-formed feces,not adhere to the anus;Watery feces:Water stool adhering to the anus

1.5結(jié)腸通透性的測(cè)量

造模結(jié)束，對(duì)照組及模型組分別按照體重分層隨機(jī)抽取12只小鼠。小鼠禁食不禁水24 h，按文獻(xiàn)[5]并稍加改良測(cè)定小鼠結(jié)腸通透性。經(jīng)肛門插入直徑為1 mm硅膠管(末端有4個(gè)小孔)，插入距肛門深度為3 cm，注入0.5 ml肥皂水洗腸，15 min后用0.9%Nacl 0.5 ml沖洗2次。洗腸后30 min，脫頸椎處死小鼠，取全結(jié)腸，回盲部腸段結(jié)扎，由直腸端注入1.5%伊文思蘭(美國(guó)Sigma公司)0.2 ml并結(jié)扎直腸端。將結(jié)腸囊置于95%O237℃恒溫水浴，30 min后取出，將結(jié)扎處松解并沿腸系膜剪開腸腔，室溫下用6 mmol/L N-乙酰半胱氨酸漂洗至漂洗液清澈無(wú)色。將腸段置于濾紙上，恒溫箱37℃12 h烘干，稱重后放入1 ml甲酰胺55℃孵育24 h，充分萃取腸道吸收的伊文思蘭,取100 μl孵育液于酶標(biāo)儀上測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A620)，計(jì)算伊文思蘭量。以進(jìn)入腸壁內(nèi)伊文思蘭的量(μg·mg-1腸段質(zhì)量)反映結(jié)腸粘膜的通透性。

1.6結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

其余的每組12只小鼠脫頸椎處死，取全結(jié)腸。PBS漂洗后于冰盤上展平，取病變較明顯處結(jié)腸段0.5 cm，4%甲醛固定，4 μm石蠟切片，HE染色，光鏡檢查。病理學(xué)評(píng)分=炎癥嚴(yán)重程度評(píng)分+累及深度評(píng)分+隱窩損害評(píng)分+損傷面積評(píng)分。炎癥嚴(yán)重程度評(píng)分;0 無(wú)、1 輕度、2 中度、3 重度；累及深度評(píng)分;0 無(wú)、1 粘膜層、2 粘膜層及粘膜下層、3 全層；隱窩損害評(píng)分：0 無(wú)、1 約1/3隱窩受損、2 約2/3隱窩受損、3 隱窩缺失，表面上皮存在、4 隱窩及表面上皮均缺失；損傷面積評(píng)分：0 損傷面積0%、1 損傷面積1%～25%、2損傷面積26%～50%、3損傷面積51%～75%、4損傷面積76%～100%[6]。

1.7免疫組化測(cè)定結(jié)腸組織NF-κB p65

取病變較明顯的部位0.5 cm，常規(guī)固定、包埋、切片，采用Envison TM二步法測(cè)定結(jié)腸組織NF-κB p65的表達(dá)情況。NF-κB p65以細(xì)胞核陽(yáng)性為信號(hào)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率[7]。

1.8小鼠血漿TNF-α測(cè)定

采用ELISA法，取小鼠清晰非溶血的血漿樣品每只100 μl測(cè)定TNF-α。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1一般情況

對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，皮毛光亮，大便正常，食量及體重逐漸增加，無(wú)死亡；模型組小鼠于第5天逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少，皮毛不整，粘液血便，食量減少，體重增加不明顯。第8天及9天模型組小鼠各死亡1只，死亡小鼠結(jié)腸短縮、腸腔出血及擴(kuò)張。造模第1天，兩組實(shí)驗(yàn)小鼠DAI評(píng)分均為0.00±0.00，第2～9天模型組小鼠的DAI評(píng)分逐漸增高，第10天對(duì)照組小鼠DAI評(píng)分為4.58±1.16，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

Tab.

DAI:Disease activity index

*P<0.05,**P<0.01 vs control

2.2結(jié)腸通透性

對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜表面光滑，少許伊文思蘭附著；模型組小鼠結(jié)腸粘膜充血水腫，淺潰瘍形成，可見伊文思蘭深染，兩組小鼠結(jié)腸伊文思蘭的測(cè)量值(μg·mg-1腸段質(zhì)量,表3，P<0.01)。

2.3小鼠結(jié)腸大體表現(xiàn)及結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

對(duì)照組小鼠結(jié)腸形態(tài)光整，無(wú)潰瘍、出血；模型組小鼠結(jié)腸明顯短縮，腸壁充血水腫，不均勻增厚，2只小鼠結(jié)腸可見散在炎性息肉形成，腸腔直徑不一，腸壁表面可見糜爛、潰瘍及出血，病變部位以直腸端為主，對(duì)照組及模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度(cm)見表3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組織病理學(xué)見對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮完整，腺體排列整齊，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠結(jié)腸腸壁增厚，腸腺排列紊亂，炎癥細(xì)胞主要累及粘膜及粘膜下層，浸潤(rùn)范圍廣，粘膜潰瘍及隱窩膿腫形成(圖1見彩圖頁(yè)Ⅰ)，兩組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分見表3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

GroupColonlength(cm)ColonicmucosapermeabilityColonhisto-pathologyscoreControl12.00±0.955.63±1.770.00±0.00Model7.83±1.17**42.41±10.03**6.83±2.37**

**P<0.01 vs control

2.4結(jié)腸組織NF-κB p65免疫組化

對(duì)照組NF-κB p65無(wú)表達(dá)或僅少量表達(dá)，陽(yáng)性區(qū)域主要位于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的胞漿,細(xì)胞核陽(yáng)性率低。模型組較對(duì)照組表達(dá)明顯增多，陽(yáng)性區(qū)域位于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞，腸腺上皮細(xì)胞，炎癥細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞核和胞漿，核陽(yáng)性率顯著增高(圖2，表4，圖2見彩圖頁(yè)Ⅰ)。兩組小鼠NF-κB p65核陽(yáng)性率(%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5血漿TNF-α

對(duì)照組及模型組小鼠TNF-α較正常組明顯增高(表4，P<0.01)。

GroupNF-κBp65(%)TNF-α(pg/ml)Control8.33±1.4318.50±5.43Model35.83±10.27**68.08±24.63**

**P<0.01 vs control

2.6DAI、結(jié)腸通透性、TNF-α及NF-κB p65的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析提示小鼠DAI與結(jié)腸通透性(r=0.99，P<0.01)顯著正相關(guān)；小鼠結(jié)腸通透性與TNF-α(r=0.82，P<0.01)及NF-κB p65(r=0.76，P<0.01)顯著正相關(guān)；TNF-α及NF-κB p65(r=0.86，P<0.01)顯著正相關(guān)。

3　討論

UC的病因尚未完全闡明，目前認(rèn)為其發(fā)病與宿主的遺傳、環(huán)境、免疫狀況、腸道菌群等多種因素有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎性腸病患者在癥狀再發(fā)前表現(xiàn)為腸道通透性增高；炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)患者親屬中存在相關(guān)基因突變者75%腸道通透性增高[8]；多種特定基因敲除的UC模型小鼠在出現(xiàn)腹瀉、血便之前也首先出現(xiàn)結(jié)腸通透性改變[9]。因此結(jié)腸通透性改變，可能是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié),但具體機(jī)制尚未明確。

結(jié)腸上皮屏障包括完整的結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞側(cè)緣的緊密連接及粘附連接，完善的結(jié)腸上皮屏障是維持正常結(jié)腸功能的基礎(chǔ)。結(jié)腸通透性是直接及準(zhǔn)確定量評(píng)估結(jié)腸上皮屏障的主要方法。結(jié)腸內(nèi)中、大分子通過(guò)腸道屏障主要通過(guò)黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。伊文思蘭(MW960.8)是一種大分子偶氮類染料，正常情況下無(wú)法進(jìn)入結(jié)腸上皮間的間隙，腸道上皮屏障受損后它可經(jīng)上皮細(xì)胞間的緊密連接進(jìn)入消化道黏膜，并呈濃度及時(shí)間的依賴性[3]。DSS是一種肝素類硫酸多糖，本文采用2.5%DSS定量灌胃誘發(fā)小鼠UC模型，模型小鼠出現(xiàn)腹瀉、血便、消瘦等UC表現(xiàn)，DAI明顯增高，證明UC造模成功，并進(jìn)一步以伊文思蘭為指標(biāo)，比較兩組小鼠結(jié)腸通透性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型小鼠結(jié)腸通透性明顯增高，DAI增高與結(jié)腸通透性增高密切相關(guān)，說(shuō)明DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸通透性增高可能是通過(guò)破壞結(jié)腸上皮緊密連接實(shí)現(xiàn)。在結(jié)腸通透性增高的情況下，導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位，免疫功能改變及腸源性感染等發(fā)生[10]，促進(jìn)UC進(jìn)展。

NF-κB是一種高度保守的多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，主要由p50及p65兩個(gè)亞基組成。靜息狀況下，NF-κB以無(wú)活性的異三聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在自由基、前炎癥細(xì)胞因子、有絲分裂原等作用下，NF-κB能與許多細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中κB轉(zhuǎn)錄序列發(fā)生特異性結(jié)合，被激活成為有活性的p50/p65二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。由于僅p65亞基具有反式激活域，因此在IBD患者，p65的活化起主要作用。NF-κB活化后可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄生成TNF-α、NO等，而TNF-α等又可進(jìn)一步活化NF-κB形成正反饋，導(dǎo)致炎性瀑布的產(chǎn)生，而后者的過(guò)度激活將會(huì)對(duì)宿主導(dǎo)致破壞性的后果。本研究顯示模型組小鼠TNF-α較正常組明顯增高，且TNF-α增高與NF-κB p65增高密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由此推測(cè)，DSS誘導(dǎo)的ICR小鼠UC發(fā)病及進(jìn)展與DSS毒性作用下，結(jié)腸屏障受損，結(jié)腸通透性增高，結(jié)腸氧自由基及NO自由基釋放增加[3]，促進(jìn)NF-κB p65表達(dá)增高及TNF-α等炎性因子正反饋有關(guān)，改善結(jié)腸通透性，促進(jìn)結(jié)腸黏膜屏障完整可能是UC今后治療的一個(gè)方向。

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Changes of colonic permeability and its correlation with TNF-α,NF-κB p65 in ulceration colitis mice

HUANG Xun-ru1，WANG Cheng-dang1，WANG Rui-xing2，JIAO Hai-xia2△

(1.Department of Gastroenterology,the First Affiliate Hospital,Fujian Medical University,the Digestive Disease Lab of Fujian Medical University,Fujian 350005;2.Department of Physiology and Pathophysiology,Fujian Medical University,Fujian 350108,China)

Objective:To study the changes of colonic permeability and its correlation with TNF-α,NF-κB p65 in indextran sulphate sodium(DSS)-induced ulcerative colitis(UC)of mice．Methods:Forty-eight ICR mice were randomly divided into the control group and the model group.The acute UC model was induced by quantified intragastric administration of 2.5% DSS in mice.The disease activity index(DAI),histopathology scores,colonic permeability,expression of TNF-α,NF-κB p65 in colonic tissue were determined.The change of colonic permeability and its correlation with DAI,TNF-α,NF-κB p65 were analyzed.Results:Compareded with the control group,DAI colonic permeability of colonic tissue,and the expression of TNF-α NF-κB p65 in the model group were increased significantly(P<0.01,P<0.01).The increased colonic permeability correlated with DAI(P<0.01),and the expression of TNF-α(P<0.01),NF-κB p65(P<0.01)changed significantly.Conclusion:The alteration of colonic permeability and increased expression of TNF-α,NF-κB p65 may play important roles in the occurrence and development of UC.

dextran sulfate sodium;ulcerative colitis;permeability;NF-κB p65;TNF-α;mice

福建省自然科學(xué)基金(2013J01127)，福建省教育廳一般科技項(xiàng)目(JA12149)

2015-07-28

2016-01-28

△Tel：13799369171；E-mail：haixiafjmu@126.com

R574.62

A

1000-6834(2016)02-112-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.005