褐藻酸酶的制備及對海帶細胞解離的應用研究

田萍萍，崔翠菊，劉延嶺，李曉捷，梁廣津，彭捷，李言，王利芹（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東　煙臺　264003）

褐藻酸酶的制備及對海帶細胞解離的應用研究

田萍萍，崔翠菊，劉延嶺，李曉捷，梁廣津，彭捷，李言，王利芹
（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東煙臺264003）

摘要：褐藻中富含褐藻酸，應用酶解法制備褐藻單細胞和原生質(zhì)體時，高活性的褐藻酸酶是所用工具酶中的主要組分。文中介紹了用硫酸銨二級鹽析和透析袋脫鹽從鮑魚的消化腺中提取褐藻酸酶的方法，測定酶活力及蛋白含量，檢測該褐藻酸酶對海帶細胞的解離效果。結(jié)果顯示，該褐藻酸酶比活力為12 U/mg，酶活力單位為34 U/mL，得率為1.4%。用含此褐藻酸酶的酶解液解離海帶細胞，酶解3～6 h內(nèi)可得到游離單細胞及原生質(zhì)體的數(shù)量在3×105～6×105個/g。該褐藻酸酶解離海帶細胞效果顯著，且本方法簡單、快捷且經(jīng)濟。

關(guān)鍵詞：褐藻酸酶；硫酸銨二級鹽析；酶活力；海帶；原生質(zhì)體

近幾年來，褐藻單細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)成為褐藻生物技術(shù)的新型研究領域，同時也為褐藻育種技術(shù)提供了新的途徑。游離的單細胞和原生質(zhì)體通?？梢圆扇C械磨法、愈傷組織和酶解法自藻體獲得，但機械法效率低下且細胞損傷大，愈傷組織的獲得較難，而酶解法反應條件溫和，能使體細胞受到的傷害降到最低程度，故而它是目前最有效的一種獲得細胞和原生質(zhì)體的方法。褐藻的細胞間質(zhì)及細胞壁中富含褐藻酸（褐藻膠），應用酶解法制備褐藻單細胞和原生質(zhì)體時，高活性的褐藻酸酶是所用工具酶中的主要部分。

褐藻酸酶又稱為褐藻膠裂解酶或褐藻膠酶。目前用于褐藻細胞解離和解壁的褐藻酸酶，都是從海產(chǎn)食藻動物如鮑魚［1］、海螺［2］、海膽［3］等的消化腺中提取的復合酶。也有作者利用褐藻病爛處的細菌產(chǎn)生的胞外酶［4-5］，用于褐藻細胞和原生質(zhì)體的分離，從褐藻病爛處分離褐藻酸降解菌，需要不斷分離鑒定并檢驗效果，實驗繁瑣耗時長，不利于一般實驗室的應用。而市售的裂解酶多為進口商品，價格昂貴，也不利于實驗的推廣。本文依據(jù)皺紋盤鮑以褐藻如海帶為食的特性，詳細介紹了從皺紋盤鮑消化腺中提取褐藻酸酶的方法以及褐藻酸酶的活力和蛋白含量的測定方法，并檢測了該酶對海帶細胞的解離效果。

1　材料和方法

1.1材料

皺紋盤鮑購于煙臺大學水產(chǎn)品市場，挑選攝食盛期新鮮健康的皺紋盤鮑，撥開腹足即可見到褐綠色的大型腺體。帶回實驗室后，用蒸餾水將盤鮑充分洗滌后于-20℃中速凍。

實驗用海帶采自威海煙墩角海區(qū)，剪取其生長部，用滅菌海水及滅菌脫脂棉反復擦拭，置于玻璃培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺中用1.5%KI浸泡兩次，每次15 min，備用。

1.2褐藻酸酶的制備

1.2.1勻漿及抽提用手術(shù)刀切掉腹足及外套膜后，將露出的褐綠色的腺體整個剝離。在冰盤上剝離消化腺后，置于滅菌培養(yǎng)皿中迅速稱重記錄。用鑷子將消化腺置于玻璃勻漿器底部，加入8～10倍體積4℃預冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH值7.2）進行勻漿，整個勻漿過程必須保持在冰浴環(huán)境中，勻漿時間10～20 min，至消化腺全部水融。在低溫環(huán)境下將組織懸液移入50 mL離心管中，置于4℃冰箱內(nèi)靜置抽提10～13 h或過夜。

1.2.2硫酸銨二級鹽析將抽提液配平，用高速冷凍離心機離心（20 000×g，4℃，30 min），留取上清液Ⅰ到燒杯中，在低溫環(huán)境下將有上清液Ⅰ的燒杯放到磁力攪拌器上，在緩慢攪拌的情況下，逐次加入固體硫酸銨到30%的飽和度。硫酸銨溶解后繼續(xù)緩慢攪拌約30 min，離心（20 000×g，4℃，30 min），留取上清液Ⅱ到燒杯中，在低溫環(huán)境下將有上清液Ⅱ的燒杯放到磁力攪拌器上，在緩慢攪拌的情況下，逐次加入固體硫酸銨到90%的飽和度。待硫酸銨全部溶解后繼續(xù)緩慢攪拌約2～3 h后可過夜靜置，離心（20 000×g，4℃，30 min～1 h），留取沉淀，用10～20 mL磷酸緩沖液溶解即得到粗提酶液。

1.2.3透析脫鹽

1.2.3.1透析袋預處理本研究透析袋購自北京索萊寶，截留分子量為12 000～14 000 Da。剪取15 cm的透析袋，在2%（m/V）碳酸氫鈉和1 mmol/LEDTA （pH為8.0）中煮沸10 min，用蒸餾水漂洗2～3次；再置1 mmol/L EDTA（pH值為8.0）中煮沸10 min，待透析袋冷卻，存放于4℃，應確保透析袋始終浸沒在液體中。使用前用蒸餾水將透析袋里外加以清洗，從此步起用透析袋時一定要戴手套操作。

1.2.3.2透析脫鹽透析袋一端扎緊，加入待透析的溶液及一段玻璃棒（兩頭燒圓），另一端多回折幾次，用透析袋夾夾緊，讓透析袋豎立于含透析液及轉(zhuǎn)子的大燒杯中，冰浴環(huán)境下磁力攪拌。一天換3～4次透析液，透析2～3 d。透析效果的檢測可用1% BaCl2，取一滴加入透析液中，若無白色沉淀生成，證明透析已完成。

1.2.4凍干及保存透析結(jié)束后，將復合酶液轉(zhuǎn)入燒杯中，預留2 mL測酶活力和蛋白含量。將復合酶液倒入玻璃平皿中，預先在-20℃速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃過夜冷凍后，用五環(huán)真空冷凍機制成凍干粉，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3酶學性質(zhì)測定

1.3.1酶活力的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）［6］測定褐藻酸酶的活力。3，5-二硝基水楊酸法是利用褐藻酸酶水解褐藻酸鈉，產(chǎn)生葡萄糖醛酸，能將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基化合物，再利用比色法測定其還原物生成量來表示酶的活力大小。其定義為每分鐘催化褐藻酸水解生成1 μg葡萄糖醛酸的酶量為一個活力單位。

1.3.1.1標準曲線的制作精確稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，用重蒸水溶解后定容至100 mL，此溶液的濃度就為1 000 μg/mL。

將1 000 μg/mL的葡萄糖溶液按照表1所示配制成各種不同濃度的葡萄糖溶液。

表1　不同濃度葡萄糖溶液的配制

向1—6管中分別加入3，5-二硝基水楊酸顯色液3 mL，在沸水浴中顯色15 min，冷卻后，再分別加入重蒸水21 mL，充分搖勻，以1號管作為空白對照，在550 nm處比色，讀取其余各管光密度值。以光密度值為縱坐標，以葡萄糖微克數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.3.1.2樣品測定樣品測定設空白對照管和測定管，按照表2所示進行操作。

1.3.1.3褐藻酸酶活力計算在上述實驗條件下，每分鐘催化褐藻酸水解生成1 μg葡萄糖醛酸的酶量定義為一個活力單位。

褐藻酸酶活力單位=n×OD550/30×1

式中，n為稀釋倍數(shù)，30為反應中糖化所用時間，1為反應中所用的酶液體積。

1.3.2考馬斯亮藍法（Bradford法）測定褐藻酸酶蛋白質(zhì)的含量［7］

本法依據(jù)在酸性溶液中考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸會結(jié)合形成藍色復合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.2.1標準曲線的制作精密量取對照品溶液0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL分別置具塞試管中，各加水至0.1 mL，再分別加入酸性染色液5.0 mL，立即混勻，以0號管作為空白，在595 nm的波長處測定吸光度。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.3.2.2樣品測定另精密量取供試品溶液0.1 mL，加入酸性染色液5.0 mL，立即混勻。以0號管作為空白，在595 nm的波長處測定吸光度，從回歸方程計算樣品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。

1.4海帶細胞解離實驗

酶解方法依據(jù)Matsumura［8］的方法稍作修改，將事先滅菌好的海帶生長部小塊，用剪刀剪成1～2 mm2的碎塊，取0.3 g置于事先配好的1 mL酶溶液中（0.4 mol/L甘露醇，2%褐藻酸酶，1%纖維素酶，1%果膠酶），在20℃搖床上120 r/min酶解3～6 h。然后用400目篩絹過濾去除未酶解組織塊和細胞團，離心（2 000 r/min，10 min）收集游離的單細胞及原生質(zhì)體，用單細胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)液稀釋后，鏡檢并計數(shù)。

表2　褐藻酸酶活力測定加樣方法

2　結(jié)果

2.1褐藻酸酶制備及酶活力測定

由表3得知，用硫酸銨二次鹽析及透析法脫鹽凍干得到酶粉，其得率在1.4%，酶活力單位在34 U/ mL，比活力在12 U/mg。第二批比第一批的活力及得率均高，區(qū)別是第二批制備復合酶時硫酸銨第二次鹽析后在4℃過夜靜置，溶液中出現(xiàn)絮狀沉淀，離心10 000 g，45 min。結(jié)果表明第二次鹽析后靜置一定時間（5～12 h）且適當延長離心時間對提高酶活有效。

表3　褐藻酸酶的活力測定及得率

圖1　葡萄糖和蛋白質(zhì)含量測定的標準曲線及其回歸方程

2.2褐藻酸酶學性質(zhì)測定的標準曲線及回歸方程

考馬斯亮藍與待測樣品混合2 min后檢測其吸光值，并在5～20 min內(nèi)測定光吸收，因為這段時間的顏色最穩(wěn)定；蛋白-染料復合物會有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿，因不易洗去，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇漂洗，以洗去染色。標準曲線會有輕微非線性，對測定結(jié)果的影響不大。

2.3褐藻酸酶對海帶細胞的解離效果

由圖2可知，在酶解3～6 h的時間段內(nèi)均可獲得質(zhì)量很好，數(shù)量較多的單細胞及原生質(zhì)體。用血球計數(shù)板計算每克組織得到的游離單細胞及原生質(zhì)體的數(shù)量在3×105～6×105個/g，可以滿足單細胞或原生質(zhì)體繼續(xù)培養(yǎng)的數(shù)量級要求。

圖2　經(jīng)酶解后游離的海帶單細胞（400×）

3　結(jié)論

利用硫酸銨二級鹽析和透析袋脫鹽等純化方法，從鮑魚的消化腺中得到的褐藻酸酶的比活力為12 U/mg，酶活力單位為34 U/mL，得率為1.4%。制備過程中收集了30%～90%飽和度硫酸銨的沉淀物，所得到的酶幾乎是含有鮑魚消化腺中所有的水解酶，雖得率不高，但用于海帶單細胞及原生質(zhì)體的分離效果很好，且本方法簡單、快捷且經(jīng)濟，一般實驗室均可以完成。

4　討論

值得注意的是，加入硫酸銨時，先少量加入，等完全溶解后再加入新的，避免燒杯底部出現(xiàn)未溶解的鹽，局部高濃度的鹽溶液易導致酶失活并且攪拌時力度要輕。待硫酸銨全部溶解后繼續(xù)輕輕攪拌30 min后可靜置一段時間，30%飽和度時靜置2～3 h，30%～90%飽和度時靜置5～6 h或過夜，這樣更利于酶蛋白的析出。制備有活力的酶時，均要在冰浴環(huán)境下操作，可很大程度的避免酶失活。

透析過程中，透析時間超過2～3 d后，繼續(xù)透析的話，透析時間越長，酶活降低越多，透析時采用低溫環(huán)境中磁力攪拌和增大透析液的體積可以加快透析速度，減少酶活損失。

目前從鮑魚、海螺或海膽中提取酶的報道中，關(guān)于酶制備方法的描述較簡單，很多實驗的細節(jié)沒有體現(xiàn)。本文詳細的描述了從皺紋盤鮑消化腺中提取褐藻酸酶的方法以及實驗過程的注意事項，同時給出了褐藻酸酶的活力和蛋白含量的測定方法，并檢測了該酶對海帶細胞的解離效果，這對于在生產(chǎn)一線的技術(shù)人員更具有現(xiàn)實的指導意義。

參照本實驗方法制備的褐藻酸酶對海帶細胞的解離效果比之前報道的用昂貴的商品酶解離效果甚至要好一些。商品酶的使用對酶解條件和酶解液的離子環(huán)境要求很高，而本實驗制備的褐藻酸酶的使用條件則更簡單，不用再對實驗條件進行反復摸索，節(jié)省了大量的時間。

實驗制備的褐藻酸酶對新鮮幼嫩的海帶細胞的解離效果很好，而對較老的材料則要適當提高褐藻酸酶的濃度和酶解時間，較老的材料中膠狀雜質(zhì)稍多一些，這可能與海帶生長期間褐藻膠的含量變化有關(guān)。

參考文獻：

［1］Yamaguchi K，Araki T，Aoki T，et al.Algal cell wall-degrading enzymes from viscera of marine animals［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1929（55）：105-110.

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［7］Nakada，H.T.，Sweany，P.C.Alginic acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas［J］.J.Biol.Chem，1967 （242）：845-851.

［8］Matsumura W.Efficient isolation and culture of viable protoplasts from Laminaria longissima Miyabe（Phaeophyceae）［J］. Bulletin of the Faculty of Fisheries，Hokkaido University，1998，49（3）:85-90.

資助項目：國家科技支撐計劃項目（2012BAD55G01）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA10A406）；煙臺市科技發(fā)展計劃項目（2013LGS002）

中圖分類號：Q176

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2091（2016）07-0010-05

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.003

收稿日期：（2015-12-14）

作者簡介：田萍萍（1983-），女，碩士，工程師，主要從事海藻遺傳育種工作.E-mail：pptian2010@163.com

Alginase preparation and application for dissociation of kelp cells

Tian Pingping，Cui Cuiju，Liu Yanling，Li Xiaojie，Liang Guangjin，Peng Jie，Li Yan，Wang Liqin
（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co.Ltd，National Alage and Sea cucumber Project Technology Research Centre，Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province，Yantai 264003，China）

Abstract：Brown algae is rich in algin，to obtain single cell and protoplast from brown algae by enzyme hydrolysis，high active alginase is the main component of the enzyme used.The method of extracting alginase from digestive gland of abalone by secondary salting out with ammonium sulfate and desalination with dialysis bag was introduced in detail.The enzyme activity and protein content were determined.The effect of disintegration seaweed cells was tested.The results showed that specific activity of alginase is 12 U/mg，the unit of enzyme is 34 U/mL and the yield is about 1.4%.To dissociate kelp cells with the enzymes containing alginase prepared，3× 104～6×105free cell and protoplasts per gram of kelp tissue digested within 3 to 6 hours.The alginase obtained showed remarkable effect for digest kelp cells and this preparation method is simple，quick and economic.

Key words：alginase；secondary salting out with ammonium sulfate；enzyme activity；kelp；protoplast