金英黃歸湯中幾個(gè)有效成分的分析

周送桂，，李　欣，李中改，張小藝，王　魯，何　珺

（1.貴州大學(xué)貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

金英黃歸湯中幾個(gè)有效成分的分析

周送桂1，2，李欣3，李中改3，張小藝3，王魯1，何珺1

（1.貴州大學(xué)貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

為了研究自制金英黃歸湯中的有效成分。采用紫外分光光度法和高效液相色譜法定量檢測金英黃歸湯中幾個(gè)有效成分，以期為金英黃歸湯的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。結(jié)果：紫外分光光度法測得金英黃歸湯中總皂苷、總黃酮和總多糖的含量分別為1.835 mg/mL和0.091 mg/mL、98.96 mg/mL；高效液相色譜法測得金英黃歸湯中槲皮素、蘆丁、木犀草素、綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、阿魏酸的含量分別為1.69 μg/mL、1.70 μg/mL、0.71 μg/mL、32.45 μg/mL、36.43 μg/mL、3.56 μg/mL、0.95 μg/mL。表明綠原酸、連翹酯苷A、總多糖在金英黃歸湯中占有較大的含量，可以確定為本制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

金英黃歸湯；紫外分光光度法；高效液相色譜法；有效成分分析

我們前期試驗(yàn)研制的金英黃歸湯對(duì)金黃色葡萄球菌引起乳房炎的家兔血清及乳汁中IL-6和TNF-α的分泌有顯著的抑制作用[1-2]，在奶牛隱性乳房炎的治療方面也取得良好的效果[3]。本復(fù)方是由金銀花、連翹、蒲公英、大黃、當(dāng)歸等組成的中藥制劑，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效[3]。為了探明其所含有的主要有效成分，進(jìn)而完善其質(zhì)量控制體系，提高其臨床用藥的安全性與有效性，我們采用紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其中幾個(gè)有效成分進(jìn)行分析。以期為其制劑的質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究金英黃歸湯提供一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料金銀花、蒲公英、當(dāng)歸等7味中藥，2013年購自貴陽市同濟(jì)堂藥店（藥品GMP證號(hào)：QianJ0190）；芙蓉花，2013年10月采自貴陽花溪濕地公園。

1.2試劑綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：119753-201314，純度>96.65）；連翹酯苷A對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：HN1116XA13，純度≥98%）；槲皮素對(duì)照品（美侖生物技術(shù)有限公司、批號(hào)：MB2127，純度≥98%）；大黃素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：GR43-NH03，純度≥98%）；蘆丁對(duì)照品（Sigma，批號(hào)：14H05521，純度≥95%）；木犀草素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YA0408YA13，純度≥98%）；皂苷對(duì)照品與黃酮對(duì)照品，均購自中國藥品生物制品檢定所，有機(jī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純?cè)噭?/p>

1.3主要儀器Agilent 1260 Infinity液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；SPD-10A紫外檢測器，北京京科瑞達(dá)科技有限公司；MultiskanGo型全波段酶標(biāo)儀，Thermo公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞萊生化儀器廠；SG2200H超聲波清洗機(jī)，上海冠特超聲儀有限公司。

1.4方法

1.4.1金英黃歸湯的制備將8味中藥按比例混合，稱取200 g，按參考文獻(xiàn)[4]的方法制備成1 mg/mL的金英黃歸湯。

1.4.2紫外分光光度法分析制劑中總皂苷、總黃酮和多糖參考文獻(xiàn)[6-7]，建立皂苷對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取經(jīng)干燥至恒重的金英黃歸湯的固體粉狀0.0030 g，精密加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻，置60℃恒溫水浴加熱20 min，取出，立即置冰水浴中冷卻15 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，同時(shí)做空白。于560 nm測定其吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總皂苷的含量。

按[8-9]建立黃酮對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取經(jīng)干燥至恒重的金英黃歸湯的固體粉狀0.5 g 2份，分別定容至50 mL容量瓶中，精密吸取樣液0.5 mL，加入干燥具塞試管中，依次加入9 mL的0.1 mg/mL三氯化鋁，再依次分別加入0.5 mL的蒸餾水，搖勻，于420 nm處測定吸光度，同時(shí)做試劑空白。測定其吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮的含量。

按參考文獻(xiàn)[10-11]建立葡萄糖對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取金英黃歸湯0.01 mL至具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，搖勻，加1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，迅速搖勻，室溫靜置10 min，40℃條件下放置18 min，用蒸餾水做空白，在490 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其多糖含量。

1.4.3HPLC法分析制劑中槲皮素、蘆丁、木犀草素、綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、咖啡酸。

1.4.3.1槲皮素的含量測定按參考文獻(xiàn)[12-13]用甲醇制備0.291 mg/mL的槲皮素對(duì)照品溶液。另外精密量取金英黃歸湯0.1 mL，置于25 mL的具塞錐形瓶中，加9.9 mL的水解液（甲醇∶4 mol/L鹽酸=7∶3）溶解，超聲處理至完全溶解，放置冷卻，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得濃度為10 mg/mL的供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，在流動(dòng)相為甲醇∶0.4%磷酸（48∶52），流速為0.8 mL/min，柱溫為45℃，檢測波長為360 nm的色譜條件下檢測。根據(jù)公式（C 樣=C標(biāo)×A樣/A標(biāo)）計(jì)算槲皮素的含量。

1.4.3.2蘆丁的含量測定按參考文獻(xiàn)[14-15]用甲醇制備0.050 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。另精密量取金英黃歸湯0.1 mL，以蘆丁流動(dòng)相為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在流動(dòng)相為甲醇∶0.4%磷酸（32∶68），檢測波長為360 nm，柱溫為30℃，流速為0.8 mL/min的色譜條件下檢測。根據(jù)上述公式計(jì)算蘆丁的含量。

1.4.3.3木犀草素的含量測定按參考文獻(xiàn)[16-17]用甲醇制備0.270 mg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液。另精密量取金英黃歸湯0.1ml，以甲醇：25%鹽酸（4∶1）為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在流動(dòng)相為四氫呋喃∶甲醇∶1.5%醋酸（27∶4∶69），流速為1.0 mL/min，檢測波長為353 nm，柱溫為40℃的色譜條件下檢測。根據(jù)上述公式計(jì)算木犀草素的含量。

1.4.3.4綠原酸的含量測定按參考文獻(xiàn)[18-19]，用綠原酸流動(dòng)相（乙腈∶0.2%磷酸（11∶89）制備0.217 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液。另精密量取金英黃歸湯0.1 mL，以綠原酸流動(dòng)相為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在檢測波長為327 nm，柱溫為35℃，流速為0.8 mL/min的色譜條件下檢測。根據(jù)上述公式計(jì)算綠原酸的含量。

1.4.3.5連翹酯苷A的含量測定按參考文獻(xiàn)[20-21]用連翹酯苷A流動(dòng)相（乙腈∶0.4%冰醋酸（17∶83）制備0.268 mg/mL的連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另精密量取金英黃歸湯0.1 mL，以其流動(dòng)相為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在檢測波長為330 nm，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min的色譜條件下檢測。根據(jù)上述公式計(jì)算連翹酯苷A的含量。

1.4.3.6連翹苷的含量測定按參考文獻(xiàn)[14，18]用甲醇流動(dòng)相制備0.249 mg/mL的連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另精密量取金英黃歸湯0.1 mL，以甲醇為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在以乙腈∶水（25∶75）為流動(dòng)相，檢測波長為227 nm，柱溫為25℃，流速為1.0 mL/min的色譜條件下檢測。根據(jù)上述公式計(jì)算連翹苷的含量。

1.4.3.7阿魏酸的含量測定按參考文獻(xiàn)[22]用70%甲醇制備0.268 mg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另精密量取金英黃歸湯0.1 mL，以70%甲醇為溶劑，按“1.4.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液與進(jìn)樣，在以乙腈∶0.085%磷酸溶液（17∶83）為流動(dòng)相，檢測波長為316 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min的色譜條件下檢測。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1金英黃歸湯中總皂苷、總黃酮、總多糖的含量測定根據(jù)測定的結(jié)果，以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1、2、3）。得出皂苷直線回歸方程為y=4.6097x-0.0210（R2=0.9960），黃酮直線回歸方程為y=3.9243x+0.0100（R2=0.9624），多糖直線回歸方程為y=2.9878x-0.1509（R2=0.9995）。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得金英黃歸湯凍干粉中總皂苷、總黃酮和總多糖的含量分別為1.835 mg/mL、0.091 mg/mL、98.96 mg/mL。

圖1　皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2槲皮素、蘆丁、木犀草素、綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、咖啡酸的含量測定槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如4、5圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出金英黃歸湯中槲皮素含量為1.69 μg/mL。

圖4　槲皮素對(duì)照品HPLC色譜圖

圖5　槲皮素供試品HPLC色譜圖

盧丁標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如6、7圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出盧丁含量為1.70 μg/mL。

木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如8、9圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出木犀草素含量為0.71 μg/mL。

圖6　蘆丁對(duì)照品HPLC色譜圖

圖7　蘆丁供試品HPLC色譜圖

圖8　木犀草素對(duì)照品HPLC色譜圖

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如10、11圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出綠原酸含量為32.45 μg/mL。

連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如12、13圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出連翹酯苷A含量為36.43 μg/mL。

圖9　木犀草素供試品HPLC色譜圖

圖10　綠原酸對(duì)照品HPLC色譜圖

圖11　綠原酸供試品HPLC色譜圖

圖12　連翹酯苷A對(duì)照品HPLC色譜圖

圖13　連翹酯苷A供試品HPLC色譜圖

連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如14、15圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出連翹苷含量為3.56 μg/mL。

圖14　連翹苷對(duì)照品HPLC色譜圖

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖與供試品HPLC圖如16、17圖所示，根據(jù)公式計(jì)算，得出阿魏酸含量為0.95 μg/mL。

圖15　連翹苷供試品HPLC色譜圖

圖16　阿魏酸對(duì)照品HPLC色譜圖

3　討論

中藥作為治療疾病的藥品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保證其臨床用藥安全性的關(guān)鍵，其中質(zhì)量控制是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的主要部分。但中藥大部分是復(fù)方藥，其成分復(fù)雜難以一一確定，對(duì)于中藥復(fù)方的質(zhì)量控制只能做到對(duì)其主要有效成分進(jìn)行含量的控制。本文的研究目的旨在前期對(duì)金英黃歸湯的定性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過紫外分光光度法和高效液相色譜對(duì)其中幾個(gè)有效成分進(jìn)行含量測定，來探討出金英黃歸湯中的主要有效成分，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。

圖17　阿魏酸供試品HPLC色譜圖

近年來皂苷類和黃酮類化合物的藥理作用是研究熱點(diǎn)，皂苷具有抗缺氧、抗疲勞、抗脂質(zhì)氧化及抗癌等作用，黃酮具有降低血脂、抗肝病毒、抗炎、抗菌與抗病毒及解痙等作用。此外，中藥多糖因其具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗?jié)?、抗糖尿病、降血脂、抗凝血及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用也越來越引起人們的關(guān)注。本課題組在金英黃歸湯中藥化學(xué)成分定性結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合前期金英黃歸湯藥效的研究對(duì)金英黃歸湯中總皂苷、總黃酮和多糖進(jìn)行含量測定。測得金英黃歸湯中總皂苷、總黃酮和多糖的含量分別為1.835 mg/mL、0.091 mg/ mL和98.96 mg/mL。這為下一步金英黃歸湯的有效成分研究及藥效評(píng)價(jià)提供了可靠的數(shù)據(jù)。

金銀花、蒲公英、連翹為金英黃歸湯的主藥，2010年版藥典[16]中也增加了金銀花中綠原酸的含量測定和連翹中連翹酯苷A的含量測定指標(biāo)。因而將金銀花中綠原酸和木犀草素，蒲公英中蘆丁，連翹中槲皮素、連翹酯苷A和連翹苷及大黃中大黃素當(dāng)歸中阿魏酸也確定為本試驗(yàn)含量測定的對(duì)象。為了考察這幾個(gè)有效成分經(jīng)過制備工藝后含量的改變，我們采用HPLC對(duì)這幾個(gè)有效成分進(jìn)行了含量測定。定量試驗(yàn)結(jié)果表明，金英黃歸湯中含量較多的是綠原酸與連翹酯苷A和總多糖，測得其含量分別為3.245 μg/mL、3.643 μg/mL和98.96 mg/mL。而槲皮素、蘆丁、木犀草素、連翹苷、阿魏酸經(jīng)過金英黃歸湯的制備過程后含量比較低，測得含量結(jié)果分別為0.169 μg/mL、0.170 μg/mL、 0.071 μg/mL、3.56 μg/mL及0.95 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果說明，綠原酸與連翹酯苷A和總多糖在金英黃歸湯的制備過程中比較穩(wěn)定且含量較高，可以確定為金英黃歸湯的質(zhì)量控制指標(biāo)及后期研究的主要有效成分對(duì)象。

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Theanalysis of several effectivecomponents ofJ inying Huangguipreparation

ZHOU Song-gui1，2，LI Xin3，LI Zhong-gai3，ZHANG Xiao-yi3，WANG Lu1，HE Jun1
（1.Biochemistry Engineering Center of Guizhou Province，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.College of pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

To study the ingredient of Jinying Huanggui prepared by our laboratory.In order to provide certain reference basis for future experiments about the quality control of Jinying Huanggui，some active ingredients were quantitatively detected by Ultra?violet spectrophotometry and High performance liquid chromatography.The content of total saponin，total flavone and total polysac?charides of Jinying Huanggui measured by Ultraviolet spectrophotometry were 1.835 mg/mL-1，0.091 mg/mL-1and 98.96 mg/mL-1，respectively.The contents of quercetin，rutin，mignonette，chlorogenic acid，forsythosides A，phillyrin and ferulic acid measured by High performance liquid chromatography were 1.69 μg/mL-1，1.70 μg/mL-1，0.71 μg/mL-1，32.45 μg/mL-1，36.43 μg/mL-1，3.56 μg/ mL-1and 0.95 μg/mL-1，respectively.chlorogenic acid，forsythosides A and total polysaccharides are the highly possessed content in Jinying Huanggui and can be used as quality control index.

Jinying Huanggui preparation；Ultraviolet spectrophotometry；High performance liquid chromatography（HPLC）；Effective composition analyze

HE Jun

S853.9

A

0529-6005（2016）07-0047-05

2015-07-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260618）

周送桂（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)，E-mail：565345638@qq.com

何珺，E-mail：hejun1016@163.com