貉源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張召興，耿田田，李蘊(yùn)玉，賈青輝，張艷英，張香齋，李佩國，史秋梅

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 昌黎 066604）

貉源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張召興，耿田田，李蘊(yùn)玉，賈青輝，張艷英，張香齋，李佩國，史秋梅

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 昌黎 066604）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella Multocida）又稱多殺巴斯德菌，多殺巴斯德菌含3個(gè)亞種，屬于巴斯德菌屬，可以引起人及多種動(dòng)物發(fā)病[1]。在動(dòng)物的感染表現(xiàn)并有相應(yīng)的專用疾病名稱，如豬肺疫、毛皮動(dòng)物巴氏桿菌病等[2]。于愛紅等[3]報(bào)道了該菌導(dǎo)致人手術(shù)切口感染?？梢詫?dǎo)致人的不同器官感染[4]。該病原菌發(fā)生無明顯季節(jié)性、環(huán)境條件、飼養(yǎng)條件改變等不良因素致使機(jī)體的抵抗力下降，促進(jìn)病原菌大量增殖并引起發(fā)病[5]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

近幾年，毛皮動(dòng)物狐、貉、貂的細(xì)菌病種類多、血清型復(fù)雜，尤其是呼吸道性疾病往往與其他細(xì)菌混合感染[6]。貉的巴氏桿菌病未見報(bào)道。本試驗(yàn)從病貉肺臟、肝臟、心血等組織進(jìn)行分離培養(yǎng)的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定其耐藥譜，科學(xué)指導(dǎo)用藥。為下一步為預(yù)防和控制該病流行提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病料來源送檢的病貉，無菌采集病貉肺臟、肝臟、心血等組織進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2主要試劑DL-2 000 Marker、2×Taq Marker Mix、樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條法國梅里埃（bioMerieuxsa）公司產(chǎn)品；常規(guī)的試劑有本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重20 g左右健康昆明系小鼠8只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4細(xì)菌分離純化無菌采取無菌采集病貉肺臟、肝臟、心血等組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12～24 h。

1.5細(xì)菌形態(tài)特征與培養(yǎng)特性無菌挑取上述純化培養(yǎng)菌，再分別“Z”字形劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察其生長情況。選取優(yōu)勢(shì)生長菌落移接于營養(yǎng)肉湯進(jìn)行純培養(yǎng)供鑒定用。

1.6細(xì)菌生化特性鑒定用ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化試驗(yàn)，用自動(dòng)ATB生化儀測(cè)定。

1.7多殺性巴氏桿菌KMT基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取基因組DNA，參照文獻(xiàn)[7]多殺性巴氏桿菌的KMT基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，P1：5′-TA?AAC-GAACTCGCCACT-3′，P2：5′－TGGGCTTGTC?GG-TAGTCTT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段為348 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Marker Mix 25 μL，ddH2O 19 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板4.0 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，46℃退火50 s，72℃延伸50 s，72℃中延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中，120 V電泳25 min，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenB?nak數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.8致病性試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為2組，每組4只，每只小鼠0.2 mL（1×109CFU/mL）腹腔注射；同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照。觀察發(fā)病及死亡情況，分離細(xì)菌并鑒定。

1.9藥敏試驗(yàn)按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)和結(jié)果判斷[8]。

2　結(jié)果分析

2.1細(xì)菌形態(tài)特征與培養(yǎng)特性鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，生長良好，可見均勻一致的灰白色、圓形、濕潤，不溶血的露珠樣小菌落，在普通瓊脂上生長貧瘠。涂片染色鏡檢，可見革蘭氏陰性短桿菌，散在或成雙，美藍(lán)染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色。

2.2細(xì)菌生化特性鑒定采用自動(dòng)ATB細(xì)菌鑒定儀，利用ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化鑒定，分離菌發(fā)酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、鼠李糖，精氨酸雙水解酶陰性，鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、氧化酶為陽性，吲哚試驗(yàn)為陽性。鑒定結(jié)果為多殺性巴斯德菌，評(píng)定結(jié)果合格率為99.5%。

2.3多殺性巴氏桿菌KMT基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序用多殺性巴氏桿菌種特異性KMT基因?qū)υ摼M(jìn)行的PCR鑒定，擴(kuò)增出大約為348 bp的目的條帶，結(jié)果見圖1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，與Gen?Bank DNA序列數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的多殺性巴氏桿菌Kmt1基因（NO.AF016259）序列同源性為100%，確定該從病貉分離的菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖1　多殺性巴氏桿菌特異性KMT基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠24 h左右全部發(fā)病死亡。分離培養(yǎng)鑒定、PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示所分離菌與注射的病原細(xì)菌一致。對(duì)照組4只小鼠健康存活，表明該菌有一定致病性。

2.5藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)頭孢噻呋、氟苯尼考、阿米卡星、氧氟沙星、阿莫西林敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素等耐藥，結(jié)果見表1。

表1　細(xì)菌藥敏結(jié)果

3　討論

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，多殺性巴氏桿菌，染色鏡檢，呈革蘭陰性短桿菌，散在或成雙，美藍(lán)染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色。培養(yǎng)特性表明，了鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，長勢(shì)良好，在普通瓊脂上生長貧瘠。生化試驗(yàn)鑒定：分離菌發(fā)酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、鼠李糖；接觸酶和氧化酶、鳥氨酸脫羧酶為陽性，吲哚試驗(yàn)為陽性。通過培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察、生化鑒定，PCR方法檢測(cè)特異性KMT基因，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件比對(duì)，與多殺性巴氏桿菌同源性為100%，確定多殺性巴氏桿菌。通過人工感染小鼠致病性試驗(yàn)，試驗(yàn)組小鼠24 h左右全部發(fā)病死亡，分離培養(yǎng)鑒定、PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示所分離菌與注射的病原菌一致。對(duì)照組小鼠健康存活，證明該菌株具有致病性，是引起該貉肺炎主要病原菌，為臨床治療貉肺炎提供理論依據(jù)。

近年來，貉的犬瘟熱、腺病毒等病毒性疾病的不斷發(fā)生，細(xì)菌病也常常繼發(fā)或并發(fā)感染[9]，其中多殺性巴氏桿菌病是毛皮動(dòng)物主要的細(xì)菌性疾病之一。為了提高養(yǎng)貉效益，既要做好病毒性疾病的預(yù)防，又要對(duì)細(xì)菌性疾病進(jìn)行防治。改善衛(wèi)生環(huán)境條件，提高機(jī)體抵抗力來抗御病原菌的攻擊?？刂圃摬∮行Х椒ㄊ敲庖呓臃N和藥物治療，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)只重視犬瘟熱等病毒病疫苗的預(yù)防接種，忽略了該病的免疫，因而造成本病的多發(fā)。多殺性巴氏桿菌易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致藥物治療效果不明顯。藥敏試驗(yàn)顯示，14種抗生素中僅對(duì)頭孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考等5種藥物敏感；慶大霉素、強(qiáng)力霉素等耐藥。因此當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疾病時(shí)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)用藥，才能獲得良好的治療效果。

[1]房海，史秋梅，陳翠珍，等.人獸共患細(xì)菌病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2012：422-446.

[2]楊正時(shí)，房海.人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，2003：497-544.

[3]于愛紅，王燕，張開玲，等.多殺巴斯桿菌致手術(shù)切口感染1 例[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（18）：1143.

[4]史莉，李萍，孫光成，等.多殺巴斯桿菌引起肺部感染1例[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，18（5）：548.

[5]Dugal F，Belanger M，Jacques M.Detection of Respiratory Pathogens in Porcine Lung Tissue and Lavage Fluid[J].Canadian Jouranl of Veterinary Research，1992，56：260-264.

[6]劉曉民，張海豐，王春明，等.貂鏈球菌和巴氏桿菌混合感染的分離與鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：68-70.

[7]黃仆，代洪波，劉孟良.豬肺疫多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012，5（87）：56-63.

[8]National Committee for Clinical Laboartory Standards，Perfom?rance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s：approved standard[J].sec?onded，NCCLS document M31-A2.Wayne，USA，2000，49（21）：105-126.

[9]錢愛東，李影.毛皮動(dòng)物疾?。ǐF醫(yī)全攻略）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：183-193，235-252.

S855.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

0529-6005（2016）07-0040-02

2015-07-31

河北省科技計(jì)劃14826613D；秦皇島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院項(xiàng)目2014-04；秦皇島科技局項(xiàng)目201502A054

張召興（1988-），男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

李佩國E-mail：lpeiguo@163.com；史秋梅E-mail：shiqiumei@126.com