1株鸚鵡源多殺性巴氏桿菌的鑒定

李軍朝，邸　濤，陳　靜，劉慧謀，張信軍，王彥紅，3

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009）

1株鸚鵡源多殺性巴氏桿菌的鑒定

李軍朝1，2，邸濤1，2，陳靜1，2，劉慧謀1，2，張信軍1，2，王彥紅1，2，3

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）屬于革蘭陰性球桿菌，定居于家禽和野禽的鼻咽部，能引起宿主出血性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，但不同類型的家禽易感性不同。多殺性巴氏桿菌有5個莢膜血清型，分別為A、B、D、E和F，引起禽類動物的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型多為A型[1]。此外，有較多技術對多殺性巴氏桿菌進行分型，其中多位點序列分型技術（multilo?cus sequence type analysis，MLST）自2010年在禽源多殺性巴氏桿菌開展研究以來迅速發(fā)展[2]。本試驗從1只死亡的鸚鵡臟器中分離到1株多殺性巴氏桿菌，并對其莢膜血清型和序列型進行鑒定。

1　材料與方法

1.1材料綿羊血平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉，購自上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司；瓊脂粉與氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨與胰酶，購自OXOID公司；綿羊血、腸桿菌科細菌生化管和藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit以及莢膜血清型鑒定所需的試劑，均購自TaKaRa公司；本試驗用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2細菌分離2014年9月，揚州大學動物醫(yī)院接到1例鸚鵡突然死亡的病例，該鸚鵡死亡之前有輕微垂翅現象，排白綠色糞便，無其他表現。臨床檢查發(fā)現鸚鵡肛門附近羽毛沾有少量糞便。剖檢可見胸肌淤血，肝臟腫大。無菌條件下用接種環(huán)挑取肝臟和心臟部分組織于綿羊血瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。24 h后挑取綿羊血瓊脂平板上的單個菌落分別接種于麥康凱平板和綿羊血瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.3生化試驗采用微量生化反應管對分離到的菌株進行生化指標的鑒定，置于37℃培養(yǎng)24 h后觀察試驗結果。

1.416S rDNA基因序列分析根據文獻記載的煮沸裂解法[3]制取細菌DNA，然后按照TaKaRa公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit說明標準對模版進行PCR擴增，得到500 pb大小的酶切DNA片段后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶后切膠測序，結果與NCBI數據庫（http：//www. ncbi.nlm.gov/BLAST）進行數據比對，鑒定所屬菌種。

1.5莢膜血清型鑒定根據Townsend等描述的方法[4]，應用特異性基因引物capA對1.4中細菌DNA進行PCR，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并用已知的細菌作為陽性對照[5]。

1.6多位點序列分析采用多殺性巴氏桿菌的7個管家基因（adk，est，pmi，zwf，mdh，gdh和pgi）進行多位點序列分析[2]。PCR引物、PCR反應組成和反應條件等均參考P.multocida RIRDC MLST（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/）的數據，擴增產物經電泳鑒定后，切膠送于上海生工生物工程技術服務有限公司測序。序列經上傳后（http：//pubmlst.org/pmultoci?da_rirdc/）獲取相關的ST。

1.7藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗，藥敏片的規(guī)格為頭孢曲松鈉（30 μg/片）、氧氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、復方新諾明（23.75 μg/片）、痢特靈（300 μg/片）、美洛西林（75 μg/片）、多粘菌素B （300 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、強力霉素（30 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）、妥布霉素（10 μg/片）、氟苯尼考（30 μg/片）、新霉素（30 μg/片）。藥敏結果判定按照杭州天和微生物試劑有限公司發(fā)布的標準進行。

2　結果

2.1細菌分離血平板上分離出無色露珠狀的、均勻的半透明菌落，該菌在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。鏡檢可見分離菌為革蘭陰性的小桿菌。

2.2生化鑒定生化鑒定如表1所示，生化鑒定表明，該菌可發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、木糖，甘露醇，硝酸鹽還原陽性，符合多殺性巴氏桿菌的生化特點。

表1　細菌分離株生化鑒定

2.316S rDNA基因序列分析分離菌用16S rDNA試劑盒擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳后，出現約500 bp的目的片段，切膠后測序，結果在NCBI網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST搜索比對后，與數據庫的多殺性巴氏桿菌同源性100%。

2.4莢膜血清型測定如圖1所示：分離菌經PCR擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳后，出現約1 000 bp的目的片段，因此，該菌株應為莢膜血型A型。

2.5MLST結果分離菌分別以adk，est，gdh，mdh，pgi，pmi和zwf2引物進行PCR，結果各出現約570、641、702、620、784、739 bp和614 bp條帶，目的片段切膠測序，結果上傳數據庫（http：//pubmlst. org/pmultocida_rirdc/），獲得相應的等位基因序列號，分離菌的7個等位基因序列號est，mdh，pgi，pmi，adk，gdh和zwf分別是33，17，20，26，21，20和2，因此，ST型為129。

圖1　用PCR進行莢膜血清分型

2.6藥敏試驗藥敏試驗顯示，該菌復方新諾明和強力霉素耐藥；對慶大霉素等藥物都呈高度敏感或中度敏感；結果如表2所示。

表2　分離菌株的藥敏試驗結果

3　討論

3.1根據分離菌株的生長特點、生化特性和16S rDNA序列分析可知從病死鸚鵡體內分離出的1株多殺性巴氏桿菌，其序列型為ST129。根據MLST數據（http：//pubmlst.org/pmultocida/）最新數據可知，ST129是江蘇地區(qū)禽源多殺性巴氏桿菌的已知的惟一基因型[6]，已研究顯示在雞、鴨和鵝等家禽分離菌株為此基因型，但在鸚鵡上是首次分離到多殺性巴氏桿菌，研究表明其能在動物體內通過各種方式感染人[7]，因此，飼養(yǎng)過程中要注意一些鳥類攜帶或感染多殺性巴氏桿菌從而感染人。

3.2分離菌株生化結果顯示，該細菌除具有多殺性巴氏桿菌發(fā)酵葡萄糖和硝酸鹽還原陽性共性之外，該細菌還能發(fā)酵麥芽糖，此特點與已知文獻有差異[1]。

[1]Y M Saif.禽病學[M].1版.蘇敬良，高福，索勛，譯.北京：中國農業(yè)出版社，2005：637-692.

[2]Subaaharan S，Blackall L L，Blackall P J.Development of a multi?locus sequence typing scheme for avian isolates of Pasteurella multocida[J].Veterinary Microbiology，2010，141（3）：354-361.

[3]邵慧君，孫化露，吳白，等.1株鴨源性都柏林沙門菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：38-40.

[4]Townsend K M，Boyce J D，Chung J Y，et al.Genetic organiza?tion of Pasteurella multocida cap loci and development of a multi?plex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiol?ogy，2001，39：924-929

[5]張竹君，彭欠欠，李娟，等.4株莢膜A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013，03：5-7.

[6]Wang Y H，Zhu J，Lu C P，et al.Evidence of circulation of an ep?idemic strain of Pasteurella multocida in Jiangsu，China by multilocus sequence typing（MLST）[J].Infection Genetics and Evolu?tion，2013，20：34-38.

[7]Kagihara J M，Brahmbhatt N M，Paladino J.A fatal pasteurella empyema[J].Lancet，2014，384：468.

S858.39文獻標志碼：B

0529-6005（2016）07-0033-02

2015-03-04

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；江蘇省人獸共患病學重點實驗室資助項目（R1406）

李軍朝（1989-）,男,碩士生,主要從事臨床獸醫(yī)學的研究工作，E-mail：june5210@163.com

王彥紅，E-mail：wyh7405@163.com