超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草莓中19種農(nóng)藥殘留量

馬　琳，黃蘭淇，陳建波，尹　君，占繡萍，趙　莉*

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(上海)，上海　201103；2.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全中心，上?！?012021)

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草莓中19種農(nóng)藥殘留量

馬琳1，黃蘭淇1，陳建波1，尹君2，占繡萍1，趙莉1*

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(上海)，上海201103；2.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全中心，上海2012021)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測定草莓中19種農(nóng)藥的快速、靈敏分析方法，并將此方法應(yīng)用于草莓中農(nóng)藥殘留水平的評估。草莓樣品經(jīng)乙腈勻漿提取，NH2固相萃取柱凈化,以反相C18色譜柱分離，0.1%甲酸-水和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定量分析。運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF)考察了不同前處理方法的凈化效果，研究了草莓樣品的基質(zhì)效應(yīng)，并以空白草莓樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法確定定量下限。結(jié)果表明：19種農(nóng)藥在0.000 5～1.0 mg/L范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999；在高、中、低3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為77.3% ～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)不大于12.3 %；雙炔酰菌胺、聯(lián)苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的定量下限為0.001 mg/kg，其余均為0.01 mg/kg。該方法簡單、快速、靈敏度高，具有良好的抗基質(zhì)干擾能力，可滿足草莓中19種農(nóng)藥殘留檢測的要求。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；農(nóng)藥；殘留；草莓

設(shè)施草莓(Fragaria ananassa Duchesne)具有栽培容易、管理方便、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、收益好等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為各地種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主要內(nèi)容和農(nóng)民增收的主要途徑。草莓以其柔軟多汁、酸甜適度、芳香濃郁、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，成為廣大市民最喜愛、最普遍食用的水果品種。但值得注意的是，目前我國草莓上登記可供選用的農(nóng)藥品種少[1]，大多數(shù)農(nóng)藥缺少在草莓上使用的合理建議，亦無安全使用間隔期，從而導(dǎo)致生產(chǎn)中農(nóng)民憑經(jīng)驗(yàn)選用農(nóng)藥，隨意擴(kuò)大用藥量、隨時(shí)采摘，這對草莓的質(zhì)量安全以及消費(fèi)者健康造成巨大隱患。

當(dāng)今，世界各國對農(nóng)產(chǎn)品安全問題非常重視，如美國、日本、歐盟等國家或國際組織均制訂了農(nóng)藥在食品和農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量(MRL)[2]。日本作為我國農(nóng)產(chǎn)品的主要出口國家，在2005年“肯定列表制度”實(shí)施后，我國出口日本的植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥超標(biāo)比例逐漸增加[3]。農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為國外限制我國農(nóng)產(chǎn)品出口的新一輪技術(shù)壁壘。因此，開發(fā)一種簡單快速、準(zhǔn)確穩(wěn)定、可用于草莓中多種農(nóng)藥殘留量檢測的方法，不僅對全面加強(qiáng)草莓中的農(nóng)藥污染監(jiān)測和監(jiān)管，保障草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義，還可為我國農(nóng)產(chǎn)品對外出口提供有力的技術(shù)支撐。

目前，針對草莓中農(nóng)藥殘留的檢測方法有氣相色譜法[4-7]、液相色譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC- MS/MS)[9- 10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-12]、液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法[13]、氣相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法[12]等，但氣相色譜法和液相色譜法易受雜質(zhì)干擾，且檢測時(shí)間較長。液相色譜/氣相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜對儀器要求較高、儀器靈敏度低，對大多數(shù)殘留而言很難實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室測定。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高分辨、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)，成為近年來農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)的主流方向[11-14]。本研究選擇19種在草莓實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的殺蟲、殺菌劑進(jìn)行研究，這些目標(biāo)化合物中，僅啶蟲脒、多菌靈、聯(lián)苯肼酯、嘧菌環(huán)胺、氯蟲苯甲酰胺和啶酰菌胺建立了在草莓上的最大殘留限量[15]，且其中溴氰蟲酰胺等農(nóng)藥并未涵蓋在現(xiàn)行的GB/T 27069[16]之中，因此，本方法的建立將對評價(jià)草莓中農(nóng)藥殘留膳食安全提供有力的技術(shù)支持。

本文通過比較不同前處理方法的凈化效果，建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定草莓中19種農(nóng)藥的多殘留檢測方法。該方法簡單、快速，靈敏度與準(zhǔn)確度完全滿足果蔬中農(nóng)殘檢測要求。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀、G6460 三重四極桿質(zhì)譜儀、6530四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；T18 ULTRA-TURRAX高速勻漿機(jī)(德國IKA集團(tuán))。

19種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品中除蟲脲的純度為97%，其余均為98%。乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；PSA固相萃取柱(500 mg/6 mL)、NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Florisil固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)、PC-NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、商品化QuEChERS凈化管(天津艾杰爾公司)；0.22 μm有機(jī)相針筒式濾膜(天津艾杰爾公司)；草莓購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存，有效期1年。使用時(shí)逐級稀釋。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確移取0.5 mL單標(biāo)儲備液(雙炔酰菌胺、聯(lián)苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯各吸取0.05 mL)于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。4～6 ℃保存，有效期6個(gè)月。

1.3樣品前處理

1.3.1提取準(zhǔn)確稱取20 g(精確至0.1 g)樣品至250 mL三角瓶中，加40 mL乙腈，在高速勻漿機(jī)中勻漿1 min，收集濾液至裝有5～7 g NaCl的200 mL具塞量筒中，蓋上蓋子后，劇烈振蕩1 min，室溫下靜置1 h。取上清液10 mL，于40 ℃水浴條件下氮?dú)獯抵两?，殘?jiān)? mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶解，待凈化。

1.3.2凈化NH2固相萃取柱用5 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)活化，再將樣品轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗滌樣品瓶，每次4 mL，洗滌2次，并將洗滌液全部轉(zhuǎn)入固相萃取柱中，收集全部流出液。將其在40 ℃水浴條件下氮?dú)獯抵两珊?，? mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Proshell120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm)；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；以0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)為流動相。線性梯度洗脫程序：0 ～5 min，5% ～50% B；5 ～7 min，50%～75% B；7 ～8.5 min，75%～80% B；8.5～9 min，80%～95% B；9～13 min,95%B。

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式電離；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L/min；霧化氣壓力：0.28 MPa；毛細(xì)管電壓：3 000 V(ESI+)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：7 L/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測，各化合物的監(jiān)測離子、碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1儀器條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化以甲醇-水(50∶50)為流動相，采用單針進(jìn)樣方式，對19種目標(biāo)農(nóng)藥的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，在電噴霧正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。根據(jù)化合物的響應(yīng)，以準(zhǔn)分子離子為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，以兩個(gè)響應(yīng)信號穩(wěn)定的子離子作為定性子離子，其中響應(yīng)信號較強(qiáng)的子離子作為定量子離子，并優(yōu)化得到最佳碎裂電壓和碰撞能量。最后，結(jié)合基質(zhì)空白溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子掃描圖，進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，確定各農(nóng)藥在MRM模式下的質(zhì)譜采集參數(shù)(見表1)。

表1　MRM監(jiān)測模式下19種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)

*quantification ion

2.1.2色譜條件的優(yōu)化考察了0.1%甲酸水-甲醇(A)、0.1%甲酸水-乙腈(B)、0.2 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(C)和0.2 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈(D)4種流動相體系對19種目標(biāo)農(nóng)藥的分離效果和離子化效率。結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為C和D時(shí)，茚蟲威、除蟲脲和多菌靈的儀器響應(yīng)較低，乙酸銨的加入具有明顯的抑制離子化效果；而當(dāng)使用A和B流動相時(shí)，19種目標(biāo)化合物的響應(yīng)明顯高于C和D流動相時(shí)的響應(yīng)，這與甲酸有利于正離子模式質(zhì)譜分析的理論相吻合，相對而言乙酸銨則有利于負(fù)離子模式的質(zhì)譜分析。此外，以乙腈作為流動相時(shí)，氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威、聯(lián)苯肼酯、螺螨酯和噠螨靈的儀器響應(yīng)明顯高于甲醇流動相。因此，最終選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，流動相的梯度洗脫對目標(biāo)農(nóng)藥的色譜峰信號強(qiáng)度有很大影響，如粉唑醇、雙炔酰菌胺和啶酰菌胺等大部分農(nóng)藥隨著保留時(shí)間的延后，響應(yīng)值有1.5～3倍的增強(qiáng)。原因可能與雜質(zhì)分離或者電離時(shí)溶劑的比例有關(guān)。

在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，19種農(nóng)藥能夠在12 min內(nèi)完成分離與檢測。優(yōu)化條件下，空白草莓樣品加標(biāo)的總離子流圖見圖1。

2.2凈化方法的選擇

對比了6種凈化方式的凈化效果。方法1：PSA凈化柱，乙腈作為洗脫劑；方法2：Florisil凈化柱，乙腈-甲苯(3∶1)作為洗脫劑；方法3：NH2凈化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作為洗脫劑；方法4：PC-NH2凈化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作為洗脫劑；方法5：QuEChERS(參照AOAC 2007.01方法)；方法6：Mini-Luke方法[17]。

運(yùn)用上述6種處理方法凈化草莓空白樣品，以UPLC-Q-TOF進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描。結(jié)果顯示，在目標(biāo)化合物出峰時(shí)間段，凈化方法1～4的干擾物明顯少于方法5和6。根據(jù)分子特征查找化合物發(fā)現(xiàn)，按照方法6凈化得到的樣品中共萃物高達(dá)6 042種之多，方法5得到的共萃物也有4 924種，其他4種方法的凈化效果相當(dāng)，共萃物在2 000～3 000種之間。

在此基礎(chǔ)上，采用1～4凈化方法對19種目標(biāo)農(nóng)藥在草莓樣品中進(jìn)行加標(biāo)濃度為0.01 mg/kg的回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，方法1和3可使90%以上的目標(biāo)農(nóng)藥得到滿意的回收率；而方法2和4則只有70%目標(biāo)農(nóng)藥的回收率在70%以上，其中以吡蚜酮差別尤為明顯，在用Florisil柱或PC-NH2柱凈化時(shí)，回收率為零，而用PSA柱或NH2柱凈化時(shí)，回收率則均在70%以上。此外，相比方法3而言，方法1的成本較高，洗脫劑的毒性較大，因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇NH2柱作為固相萃取柱，采用二氯甲烷和甲醇(95∶5)為洗脫劑進(jìn)行樣品前處理，此時(shí)方法的背景干擾最小，有利于保護(hù)儀器，減少共萃物對目標(biāo)農(nóng)藥的電離影響，同時(shí)環(huán)境成本和耗材成本最低。

2.3方法評價(jià)

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)的影響基質(zhì)效應(yīng)是指從樣品中與目標(biāo)物同時(shí)提取出的共萃物對目標(biāo)物分析產(chǎn)生的影響和干擾，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)。在LC-MS/MS檢測過程中，基質(zhì)減弱效應(yīng)更為常見，這與離子的抑制作用有關(guān)[18]。基質(zhì)效應(yīng)通常與基質(zhì)種類、目標(biāo)分析物的特性、色譜分離條件等有關(guān)，可按照下式[19]進(jìn)行量化評估：

弱基質(zhì)效應(yīng)(|Mi|<20%)時(shí)，無需采取補(bǔ)償措施，而中等程度基質(zhì)效應(yīng)(20% ≤|Mi|≤50%)或強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)(|Mi|>50%)時(shí)，必須采取補(bǔ)償措施[20]，通常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法和樣品稀釋法。

按照“1.3”進(jìn)行前處理，“1.2”配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用基質(zhì)空白溶液稀釋至0.1 mg/L,并用乙腈配制同濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，按上述公式進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的量化評估，結(jié)果見表2。在草莓基質(zhì)中，噠螨靈和螺螨酯顯示中等基質(zhì)減弱效應(yīng)(Mi分別為-33.4%和-23.1%)，其他17種目標(biāo)農(nóng)藥均為弱基質(zhì)效應(yīng)。這說明使用NH2固相萃取柱和合適的洗脫劑比例，使得極性共萃物洗脫的可能性大大降低。

2.3.2線性范圍、準(zhǔn)確度及精密度配制一系列不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化條件下進(jìn)行處理，以加標(biāo)回收的方法確定化合物的定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，雙炔酰菌胺、聯(lián)苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的LOQ為0.001 mg/kg，其余15種農(nóng)藥為0.01 mg/kg。在0.000 5～1.0 mg/L范圍內(nèi)，19種目標(biāo)農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。以實(shí)際進(jìn)樣時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠出峰的最小濃度計(jì)算檢出限(LOD)，結(jié)果見表2。

表2　草莓中19種農(nóng)藥的檢出限、線性范圍、平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及基質(zhì)效應(yīng)

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，評價(jià)本方法的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果顯示，在高、中、低3個(gè)不同加標(biāo)濃度下，平行5次實(shí)驗(yàn)，19種目標(biāo)化合物的平均回收率為77.3% ～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～12.3%(見表2)，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

2.4方法的應(yīng)用

采用本方法對采自上海郊區(qū)農(nóng)貿(mào)市場的50個(gè)草莓樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表3所示。其中檢出多菌靈、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺、啶酰菌胺、聯(lián)苯肼酯、氟硅唑、吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噠螨靈和茚蟲威共10種農(nóng)藥。參照GB2763-2014《食品中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》[15]，其殘留均未超出最大限量(MRL)。

表3　草莓樣品中農(nóng)藥的殘留情況

-：not formulated(未制定) ;*temporary maximum residue limits(臨時(shí)最大殘留限量);ND：not detected(未檢出)

3　結(jié)　論

本文建立了同時(shí)測定草莓中19種農(nóng)藥的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，該法的線性關(guān)系良好，適用性和可操作性強(qiáng)，定量下限低于目前國內(nèi)外的最大殘留限量要求，符合殘留檢測要求，可用于草莓中農(nóng)藥殘留水平的評估。

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Determination of 19 Pesticides Residues in Strawberries by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Lin1,HUANG Lan-qi1,CHEN Jian-bo1,YIN Jun2,ZHAN Xiu-ping1,ZHAO Li*

(1.The Ministry of Agriculture Pesticide Quality Supervision and Inspection Testing Center(Shanghai)，Shanghai Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai201103,China;2.Shanghai Municipal Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai2012021,China )

A solid phase exaction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of 19 pesticides in strawberry.After extraction with acetonitrile,purification with NH2SPE cartridges and dissolution with methanol,the analytes were analyzed by UPLC-MS/MS on an Agilent Proshell120 EC-C18column with a mixture of 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase by gradient elution.The mass spectrometer was operated in multiple reactions monitoring(MRM) mode in positive mode.The purifying effects of 6 pretreatment methods were optimized by UPLC-Q-TOF.Matrix effects of real strawberries were studied.The limits of quantitation(LOQs),which were determined by adding standard solution to pesticide-free strawberry samples,were 0.001 mg/kg for mandipropamid,bifenazate,picoxystrobin and pyraclostrobin and 0.01 mg/kg for the others.Good linearities were obtained for 19 pesticides in the concentration range of 0.000 5-1.0 mg/L with correlation coefficients more than 0.999.The fortified recoveries at low,intermediate and high concentration levels were in the range of 77.3%-100.3%,with relative standard deviations(RSDs) not more than 12.3%.False positive results were avoided effectively due to the method’s good ablity of resistence matrix interference.All the above observations indicated that the established method was simple,efficient and sensitive,and was suitable for the determination of 19 pesticides in strawberry.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE);pesticides;residue;strawberry

2015-11-10；

2015-12-16

上海市農(nóng)委科技攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2013)第3-2號)

趙莉，碩士，高級農(nóng)藝師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管，Tel：021-64052181，E-mail：zhaoli5741@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.011

O657.65;F767.2

A

1004-4957(2016)06-0698-06