江西省C群腦膜炎奈瑟菌藥物敏感性及PFGE分子特征分析

熊長(zhǎng)輝，楊　夢(mèng)，劉曉青，徐曉倩，王　鵬，袁　輝

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江西省C群腦膜炎奈瑟菌藥物敏感性及PFGE分子特征分析

熊長(zhǎng)輝，楊夢(mèng)，劉曉青，徐曉倩，王鵬，袁輝

目的分析江西省2006-2010年分離的C群腦膜炎奈瑟菌的藥物敏感性及分子特征。方法采用E-test試紙條檢測(cè)方法對(duì)38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株進(jìn)行體外抗菌藥物敏感性檢測(cè)，利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)進(jìn)行分子特征分析。結(jié)果所有菌株對(duì)氯霉素、美洛培南、阿奇霉素、米洛環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢曲松和利福平均敏感；15(39.5%)株菌株對(duì)青霉素不敏感，18(47.4%)株對(duì)氨芐西林不敏感，25(65.8%)株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，23(60.5%)株對(duì)左氧氟沙星耐藥，11(28.9%)株對(duì)復(fù)方新諾明不敏感。PFGE分型顯示以AH1和AH2型為主，并且同一地區(qū)的帶型以同一種帶型為主。結(jié)論江西省2006-2010年分離C群腦膜炎奈瑟菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物具有較高的耐藥性，還有大部分菌對(duì)磺胺類(lèi)和青霉素類(lèi)藥物也不敏感。PFGE分型特征雖然呈多態(tài)性，但是以AH1和AH2型為優(yōu)勢(shì)克隆型。

腦膜炎奈瑟菌；分子分型；藥敏試驗(yàn)；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm) 是引起細(xì)菌性腦膜炎的主要病原菌，及時(shí)診斷和抗菌藥物的干預(yù)對(duì)臨床治療起到至關(guān)重要的作用。由于Nm菌株的分子型別和耐藥性在不斷發(fā)生變化，因此，對(duì)Nm菌株進(jìn)行分子特征分析以及抗生素耐藥性檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解Nm菌株和耐藥性的變遷情況，為臨床治療用藥和預(yù)防性服藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)尤為重要。本研究對(duì)江西省2006-2010年分離的38株C群腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行了抗生素體外敏感性實(shí)驗(yàn)和PFGE分子分型，以觀察C群Nm耐藥性和分子特征的變化趨勢(shì)。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株江西省2006-2010年從病人、密切接觸者和健康人群分離C群腦膜炎奈瑟菌菌株38株。

1.1.2參考菌株藥敏質(zhì)控菌株為S.pneumoniaeATCC 49619 菌株和PFGE的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參考菌株H9812均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2主要試劑及耗材E-test 試紙條(bioMerieux SA)、培養(yǎng)基為加5%羊血的Mueller-Hinton(M-H) 瓊脂、NheI和XbaI內(nèi)切酶(TaKaRa)，一次性Falcon 2054試管(BD公司)，一次性50 mL screw-cap tube(BD公司)， SeaKem Gold Agarose(瑞士Lonza公司)。

1.3主要儀器微量高速離心機(jī)(eppendorf)、自動(dòng)凝膠成像儀(Bio-Rad)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng) CHEF MAPPER(Bio-Rad)，細(xì)菌濁度儀(bioMerieux)，超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈安泰SW-CJ-2FD)、 二氧化碳培養(yǎng)箱(UNAIRE)、高速冷凍離心機(jī)(SIGMA 3-18K)、生物安全柜(Thermo)。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗(yàn)用無(wú)菌棉拭子刮取分純后的待測(cè)菌于無(wú)菌的M-H稀釋肉湯(用前加熱到35 ℃) 制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，然后均勻涂布于?%羊血的M-H瓊脂平板上，粘貼E-test藥敏試紙條，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18～22 h。用質(zhì)控菌株S.pneumoniaeATCC 49619做同步試驗(yàn)，根據(jù)最新版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4.2PFGE

1.4.2.1PFGE實(shí)驗(yàn)參考中國(guó)疾病預(yù)防控制中心PulseNet China 網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室推薦的腦膜炎奈瑟菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作方法對(duì)分離的38株腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行PFGE分型。實(shí)驗(yàn)菌株選用NheI限制性?xún)?nèi)切酶酶切,200 μL 體系,酶切3 h。Marker沙門(mén)菌H9812標(biāo)準(zhǔn)菌株選擇XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶酶切,其余參數(shù)與受試菌株相同。電泳條件： initial pulse：1 s； final pulse： 25 s；電壓：6 V/cm；電泳時(shí)間：16 h；溫度：14 ℃。電泳結(jié)束后，將膠塊放入1 μg/mL的EB液中染色30 min，清水脫色1 h后，凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR下觀察結(jié)果。

1.4.2.2聚類(lèi)分析PFGE圖像導(dǎo)入Bio Numerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)軟件包進(jìn)行處理，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法，條帶位置差異容許度tolerance設(shè)置為1.5%。

2　結(jié)　果

2.1藥敏試驗(yàn)15(39.5%)株菌對(duì)青霉素不敏感，18(47.4%)株菌對(duì)氨芐西林不敏感，25(65.8%)株菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，23(60.5%)株菌對(duì)左氧氟沙星耐藥，11(28.9%)株菌對(duì)復(fù)方新諾明不敏感，所有菌株對(duì)美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米諾環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢曲松7種藥物均敏感，敏感率為100.00%。

2.2PFGE

2.2.1PFGE分型38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株用NheI 限制性?xún)?nèi)切酶酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，可得到大小從20～1 200 kb的電泳片段，不同的菌株條帶數(shù)從4～12條不等。部分C群腦膜炎奈瑟菌菌株P(guān)FGE酶切指紋圖譜(見(jiàn)圖1)。

M: Salmonella reference strain H9812, lane2-14 serogroup C Neisseria meningitidis strains.圖1　C群腦膜炎奈瑟菌PFGE酶切電泳圖譜(Nhe I限制性?xún)?nèi)切酶)Fig.1　PFGE profile of serotype serogroup C Neisseria meningitidis strains digested with Nhe I

2.2.2聚類(lèi)分析對(duì)38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株的PFGE結(jié)果用Bio Numerics軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，按照100%的相似度，38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株可分為5個(gè)不同的PFGE型別，不同菌株的相似系數(shù)在52.1%～100%之間，命名參照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道傳染病室的命名方式命名，38株菌株P(guān)FGE型別分別為AH1型13株，AH2型22株， AH44型、AH45型、AH46型個(gè)1株，如圖2。

圖2　江西省C群Nm菌株P(guān)FGE聚類(lèi)分析Fig.2　Cluster analysis of serogeuop C strains by PFGE in Jiangxi Province

3　討　論

抗生素在控制各種細(xì)菌性感染、防治傳染病、降低病死率方面發(fā)揮了十分重要的作用，成為目前臨床使用最多的藥物。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，Nm 菌株的耐藥現(xiàn)象逐漸凸顯出來(lái)，由于Nm菌群結(jié)構(gòu)的改變[1-2]，其耐藥的模式也越來(lái)越復(fù)雜。因此，對(duì)Nm菌株進(jìn)行抗生素耐藥性檢測(cè)和監(jiān)測(cè)以及菌群分型，為流腦的臨床治療用藥和預(yù)防性服藥提供實(shí)驗(yàn)室的重要依據(jù)是非常有必要的。由于腦膜炎奈瑟氏菌的PFGE分析已經(jīng)被接受為 PulseNet 一種必不可少的部分[3]。所以本研究根據(jù)PulseNet China標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案和臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI) 推薦標(biāo)準(zhǔn)[4]，采用E-test 濃度梯度擴(kuò)散法，對(duì)我省近幾年的流腦患者及健康攜帶者分離的38株Nm 菌株，進(jìn)行了抗生素體外敏感性實(shí)驗(yàn)和PFGE分子分型，以觀察我省近年C群Nm菌株耐藥譜的變化趨勢(shì)以及耐藥菌株P(guān)FGE分子分型的特點(diǎn)。

我國(guó)其他地區(qū)的Nm 菌株的藥敏監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示[5]，對(duì)青霉素類(lèi)不敏感的菌株也在逐漸增多，雖然對(duì)青霉素的敏感性已經(jīng)降低，但未出現(xiàn)耐藥菌株，而本次研究我省38株Nm 菌株有8株對(duì)青霉素耐藥，耐藥率達(dá)21.1%，PFGE分子分型主要是AH2型, 對(duì)氨芐西林不敏感的有18株，占47.4%，PFGE分子分型同樣是AH2型菌株。我國(guó)Nm 菌株的環(huán)丙沙星耐藥率明顯高于其他國(guó)家，分子分型和相關(guān)基因測(cè)序結(jié)果顯示，高的耐藥率與我國(guó)流行的克隆群緊密相關(guān)[6-10]。本次研究有25株Nm 菌株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，耐藥率達(dá)65.8%，PFGE分子分型為AH2型15株，AH1型8株，AH45、AH46各1株。同時(shí)23株Nm 菌株對(duì)左氧氟沙星耐藥，耐藥率為60.5%，PFGE分子分型為AH2型17株，AH1型5株，AH45 1株。雖然喹諾酮類(lèi)藥物并不是臨床首選的治療流腦用藥，但這可能與臨床上廣泛用喹諾酮類(lèi)藥物治療其他感染有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)28.9%的菌株對(duì)復(fù)方新諾明不敏感，主要菌型為AH2型。38株Nm 菌株對(duì)美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米諾環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢曲松7種藥物的敏感率均為100.00%，這與我國(guó)其他地區(qū)分離菌株一致[11-12]。根據(jù)PFGE分型圖譜和藥敏結(jié)果分析顯示江西省2006-2010年分離到的C群Nm菌株對(duì)抗生素耐藥和不敏感主要以AH2型為主。對(duì)菌株耐藥和不敏感的抗生素主要是青霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物，所以在流腦治療和預(yù)防中對(duì)青霉素、喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

從本研究中的PFGE酶切圖譜和聚類(lèi)分析可以發(fā)現(xiàn)江西省C群Nm菌株主要為AH1和AH2型，這和我國(guó)C群流腦流行的主要型別一致。根據(jù)流行病學(xué)資料顯示江西省2006-2010年在同一地區(qū)分離的C群Nm菌株P(guān)FGE酶切圖譜帶型較為一致，同一地區(qū)同一帶型在不同年份能夠連續(xù)出現(xiàn)，不同地區(qū)分離菌株間相似性系數(shù)從52.1%～100%不等，并且病人分離菌株與其密切接觸者分離菌株帶型相似度達(dá)100%。根據(jù)本研究顯示我省近年分離到的C群Nm菌株分子分型特點(diǎn)雖然呈現(xiàn)多態(tài)性，但是以AH1和AH2型為優(yōu)勢(shì)克隆型，同一地區(qū)優(yōu)勢(shì)克隆型較為一致，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)克隆型不同，但隨著不同地區(qū)的交往和人口流動(dòng)可能會(huì)引起不同地區(qū)不同菌型的交叉?zhèn)鞑ィ瑧?yīng)引起重視。

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Drug susceptibility testing and PFGE typing ofNeisseriameningitidesserogroup C strains isolated in Jiangxi Province, China

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qin, XU Xiao-qian, WANG Peng, YUAN Hui

(JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The study was conducted to evaluate the altering patterns of antibacterial drug sensitivity and PFGE typing ofNeisseriameningitidisserogroup C strains isolated in Jiangxi Province. Isolates were subjected to a drug susceptibility test using the E-test method and Pulsed-Field Gel Electrophoresis was used to characteristics of molecules. All of the 38 strains were sensitive to chloramphenicol, meropenem, azithromycin, minocycline, cefotaxime, ceftriaxone and rifampicin; 15(39.5%) strains were not sensitive to penicillin, 18(47.4%) strains were not sensitive to ampicillin and 11 (28.9%) were not sensitive to trimethoprim sulfamethoxazole; 25(65.8%) strains were resistant to ciprofloxacin and 23(60.5%) strains were resistant to levofloxacin; PFGE belt type prompt AH1 and AH2 type in the majority. TheNeisseriameningitidisserogroup C strains were highly resistant to quinolones, while showed lower resistance to sulfonamides and penicillin isolated in Jiangxi Province. AH1 and AH2 is the main type with the gene polymorphism analysis.

Neisseriameningitidis; molecular typing; drug susceptibility test; PFGE

Supported by the Science and Technology Program of Health and Family Planning Commission of Jiangxi Province (No. 20156029)

Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

袁輝， Email：jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病預(yù)防控制中心傳染病所，南昌330029

R378.1

C

1002-2694(2016)07-0679-04

2016-02-23;

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.018

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃(No.20156029)