一起諾如病毒GⅡ.17型引起的急性胃腸炎病原學(xué)診斷及基因特征分析

姚　棟，陳靜芳，葉　文，歐新華

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一起諾如病毒GⅡ.17型引起的急性胃腸炎病原學(xué)診斷及基因特征分析

姚棟，陳靜芳，葉文，歐新華

目的對長沙市2014年12月某廠區(qū)暴發(fā)的一起急性胃腸炎疫情進(jìn)行病原學(xué)診斷及對其致病原進(jìn)一步的基因分型研究。方法共采集 6例病人肛拭子標(biāo)本和可疑水源標(biāo)本4份，提取核酸后，諾如病毒GI/GII型real-time RT-PCR試劑盒檢測；陽性標(biāo)本普通RT-PCR擴(kuò)增VP1基因片段，產(chǎn)物測序后BLAST比對確定其型別，并構(gòu)建進(jìn)化樹分析其進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果10份標(biāo)本real-time RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示為諾如病毒GII型，VP1區(qū)片段RT-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物測序，BLAST比對發(fā)現(xiàn)與2014年香港諾如病毒株GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高，達(dá)99%，證實(shí)為諾如病毒GII.17型；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示本次疫情分離的毒株與日本、香港、臺灣等亞洲地區(qū)的毒株親緣關(guān)系更為接近，而與美國、法國等地區(qū)的毒株親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。結(jié)論諾如病毒是引起此次急性胃腸炎疫情的病原體，且引起暴發(fā)的病毒株屬于GII.17型。

諾如病毒；胃腸炎；分子分型

諾如病毒(Norovirus, NoV)，又稱諾瓦克樣病毒，屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原之一，被世界衛(wèi)生組織定為B類病原，主要導(dǎo)致食源性及水源性急性腹瀉。目前世界范圍內(nèi)超過50%的急性胃腸炎均是由NoV引起的，各個(gè)年齡段人群均普遍易感，在國內(nèi)多個(gè)季節(jié)都可出現(xiàn)流行高峰[1-2]。NoV為單正鏈RNA病毒，基因組全長約7.7kb，包含3個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶，ORF2和ORF3分別編碼主要(VP1)和次要(VP2)衣殼蛋白。根據(jù)VP1區(qū)基因序列的差異，NoV可分為GI-GVI 6個(gè)基因群，感染人類的主要為GI、GII群，其中GI群至少可分為14個(gè)基因型，GII群至少可分為21個(gè)基因型[3]。

研究顯示由NoV引起的感染性腹瀉中80%由GII群引起，而GII群中又以GII.4 型為主要基因型。自20世紀(jì)90年代諾如病毒首次導(dǎo)致世界性大流行以來，GII.4型一直在流行中占據(jù)主導(dǎo)地位[4]，其他基因型如GI、GII.3等型別也有報(bào)道，但多為小范圍流行或散發(fā)病例報(bào)道[5]。

2014年12月，長沙市暮云區(qū)一廠醫(yī)院報(bào)告近2周多名村民陸續(xù)出現(xiàn)嘔吐、腹脹腹瀉等胃腸道癥狀的病例，調(diào)查顯示該廠區(qū)及周邊居民采用自備水源(280 m深地下井)集中供水，根據(jù)臨床特點(diǎn)懷疑為水源性NoV引起的感染性腹瀉，采集6名患者肛拭子標(biāo)本，4戶居民末梢水送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)檢測。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本采集6名患者肛拭子標(biāo)本，Hank’s液中保存；250 mL無菌瓶分別在4戶居民家中采集末梢水200 mL，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2主要試劑病毒RNA提取試劑盒QIAamp viral mini kit購自QIAGEN公司；諾如病毒GI/GII型real-time RT-PCR檢測試劑盒購自江蘇碩世生物有限公司；SuperScript○RⅢ One-Step RT-PCR with Platinum○RTaq試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3病毒核酸提取末梢水經(jīng)抽濾濃縮后用于核酸提取，肛拭子標(biāo)本振蕩混勻后直接用于核酸提取，具體操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4Real-time RT-PCR檢測取病毒RNA提取液5 μL用于檢測，諾如病毒real-time RT-PCR試劑盒定性檢測病毒GI/GII型，所用儀器為LC 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光PCR儀，檢測條件及GI、GII型結(jié)果的判斷參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5基因型別確定及序列分析參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[6]擴(kuò)增病毒VP1基因部分序列，所用引物序列如下，mon381: 5′-CCAGAATGTACAATGGTTATGC-3′，mon383: 5′-CAAGAG ACTGTGAAGACATCATC-3′，RT-PCR反應(yīng)條件為：55 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，68 ℃ 10 min。擴(kuò)增片段大小為323 bp，

PCR產(chǎn)物送上海英俊公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果采用BLAST程序比對鑒定其型別，并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為KR269694～ KR269703。選取GenBank中GII型諾如病毒VP1區(qū)序列，采用DNA Star軟件進(jìn)行序列同源性分析，MEGA軟件通過鄰位法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析，建樹的可靠性通過1000 bootstrap評估。

2　結(jié)　果

2.1Real-time RT-PCR核酸檢測10份標(biāo)本核酸經(jīng)real-time RT-PCR檢測，所有標(biāo)本均出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，根據(jù)檢測試劑盒說明書判斷為諾如病毒GII型陽性。

2.2病毒型別的確定為確定病毒基因型別，采用特異性引物擴(kuò)增病毒ORF2的VP1基因部分區(qū)域(圖1)，PCR產(chǎn)物測序后，與GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)與2014年香港NoV GII.17型毒株 GII/Hu/HKG/2014/GII.17/CUHK-NS-463同源性最高，達(dá)99%，證實(shí)導(dǎo)致本次疫情暴發(fā)的諾如病毒基因型別為GII.17型。10份標(biāo)本核苷酸序列同源性在96%～100%間，其中7份標(biāo)本堿基序列完全一致；氨基酸序列與上述香港地區(qū)GII.17型毒株VP1蛋白序列相比(序列號AKB94550)，肛拭子標(biāo)本Hu/14Y03/CS/CHN/2014第196、197位氨基酸發(fā)生變異，末梢水標(biāo)本water/14Y03/CS/CHN、water/14Y04/CS/CHN第197位氨基酸發(fā)生變異(圖2)。

圖1　PCR擴(kuò)增區(qū)域ORF結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　ORF structures of VP1 gene PCR amplification fragments used in this study

圖2　NoV GII.17型VP1蛋白氨基酸序列比對圖Fig.2　Amino acid sequences alignment of NoV GII.17 VP1 protein

2.3遺傳進(jìn)化樹分析從GenBank中選取NoV GII.17型、GI群及GII群其他型別病毒VP1基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3。本次疫情檢測到的10株GII.17型NoV在系統(tǒng)進(jìn)化樹中形成一獨(dú)立的小分支，與2013年臺灣、2014年香港及2013-2015年日本等地區(qū)分離到的毒株親緣關(guān)系較近，而與美國、法國等國家則距離較遠(yuǎn)，可能由于空間的距離，以及分離時(shí)間間隔較遠(yuǎn)而導(dǎo)致系統(tǒng)進(jìn)化上的差異。

圖3　NoV GII.17型VP1基因進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic analysis based on partial VP1 gene sequences of GII.17 NoV

3　討　論

NoV是一種變異頻繁的RNA病毒，其中GII.4型的變異頻率比其它基因型更高[7]，導(dǎo)致其在全世

界范圍內(nèi)的廣泛流行，甚至暴發(fā)流行，自1995年以來共監(jiān)測到7種引起大范圍暴發(fā)流行的GII.4型變異株；中國許多地區(qū)如北京、上海等地的報(bào)道也顯示GII.4型在NoV引起的急性胃腸炎中占大部分比例[8-9]，其他型別如GI型、GII.3、GII.14型等則流行程度較低，散發(fā)病例報(bào)道更常見[10]，而GII.17型流行的報(bào)道則較少見。本次由NoV引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情經(jīng)序列分析證實(shí)為GII.17型，搜索GenBank中提交的NoV GII.17型序列，我們發(fā)現(xiàn)從2012年開始，大多提交的GII.17型序列來自韓國、日本、香港、臺灣、中國廣東等亞洲地區(qū)國家，說明從2012年開始，NoV GII.17型在亞洲地區(qū)流行開始增強(qiáng)，應(yīng)引起重視。根據(jù)部分VP1基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(圖3)顯示本次疫情NoV GII.17型與香港、日本、臺灣地區(qū)分離株親緣關(guān)系接近，可能為同一遺傳進(jìn)化來源。

VP1蛋白是NoV的主要衣殼蛋白，主要與病毒結(jié)構(gòu)的組裝、與宿主間的相互作用以及免疫應(yīng)答的產(chǎn)生等生物學(xué)功能有關(guān)[11]；同時(shí)VP1蛋白也是病毒最易發(fā)生變異的區(qū)域，通過多序列比對我們發(fā)現(xiàn)污染的水樣標(biāo)本中病毒VP1蛋白本身存在個(gè)別氨基酸的差異，而從一患者體內(nèi)檢測到的病毒VP1蛋白則出現(xiàn)新的氨基酸突變位點(diǎn)(圖2，第196位氨基酸)，說明病毒在感染患者后，在與宿主相互作用過程中有新的突變產(chǎn)生。

NoV引起的腸胃炎可以通過人與人直接接觸、通過接觸污染的環(huán)境如食品、水等途徑傳播，NoV不同基因型對外界環(huán)境的抵抗力、與受體結(jié)合能力等生物學(xué)特性存在明顯區(qū)別[12]，導(dǎo)致不同基因型的流行病學(xué)特征不同，如GI型食源性傳播更常見，而GII.4型人與人之間直接傳播較為常見[13]。調(diào)查顯示本次疫情是由于NoV GII.17型污染末梢水管網(wǎng)引起，通過對末梢水消毒后發(fā)病例數(shù)明顯減少；有研究報(bào)道非洲肯尼亞河流中NoV分型顯示GII.17型占檢出陽性率的76%[14]，說明NoV GII.17型可能通過水源性的傳播風(fēng)險(xiǎn)較高，但具體流行病學(xué)特征還需大量的監(jiān)測數(shù)據(jù)反映。

NoV在遺傳上的多樣性，主要是因?yàn)閂P1蛋白的頻繁變異以及不同基因型間ORF1和ORF2的重組現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)中我們僅對NoV GII.17型VP1區(qū)部分序列進(jìn)行了分析，ORF1區(qū)基因分型及全基因組序列還有待于進(jìn)一步的研究。

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Etiology and genotype features analysis of an acute gastroenteritis outbreak associated with Norovirus GII.17

YAO Dong, CHEN Jing-fang, YE wen, OU Xin-hua

(ChangshaCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410001,China)

To identify the pathogens of an acute gastroenteritis outbreak in a factory of Changsha in December, 2014 and further analyze the genotypes of the pathogens. GI/GII norovirus of six anal swabs and four water samples were detected by real-time RT-PCR. The VP1 gene fragments of norovirus positive samples were then amplified and sequenced by RT-PCR with specific primers. BLAST alignment and phylogenetic analysis were performed based on the VP1 sequences. The ten specimens were tested norovirus GII positive and the VP1 sequences showed 99% homology with strain GII/Hu/HKG/2014/ GII.17/CUHK-NS-463 isolated in Hong Kong in 2014. It’s confirmed the norovirus genotype in this outbreak was GII.17. Phylogenetic analysis of viral VP1 sequences showed that the GII.17 norovirus in this study were closely related to strains circulating in Asian areas like Japan, Hong Kong and Taiwan, but a little far from those isolated in U.S.A and French which formed another cluster. The pathogen of this acute gastroenteritis outbreak was norovirus and the genotype was GII.17.

norovirus; gastroenteritis; genotype

Ou Xin-hua, Email: xhouteam@163.com

歐新華，Email: xhouteam@163.com

長沙市疾病預(yù)防控制中心，長沙410001

R373.3

A

1002-2694(2016)07-0641-03

2015-10-19；

2016-05-09

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.010