云南西部地區(qū)居民區(qū)小型獸類(lèi)攜帶病原體檢測(cè)

杜春紅，尹家祥，左曙青，栗冬梅，王秀芳，程曉藕，劉正祥，楊光璨

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云南西部地區(qū)居民區(qū)小型獸類(lèi)攜帶病原體檢測(cè)

杜春紅1，尹家祥2，左曙青3，栗冬梅4，王秀芳2，程曉藕2，劉正祥1，楊光璨1

目的了解云南西部地區(qū)居民區(qū)小型獸類(lèi)攜帶病原體情況，為自然疫源性疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。方法在滇西地區(qū)8個(gè)州(市)中抽取的10個(gè)縣(市、區(qū))40個(gè)自然村中，隨機(jī)抽取800戶(hù)家庭(每村20戶(hù))，進(jìn)行室內(nèi)捕鼠，采集鼠脾臟標(biāo)本并提取基因組DNA，鼠肺標(biāo)本提取RNA，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或免疫學(xué)方法，檢測(cè)鼠疫、巴爾通體、伯氏疏螺旋體、巴貝西原蟲(chóng)、人粒細(xì)胞無(wú)形體、埃立克體、漢坦病毒等病原體。結(jié)果捕獲9種421只小型獸類(lèi)，采集臟器樣本404份，血清樣本325份。檢出鼠疫F1抗體兩種方法共同陽(yáng)性血清1份；擴(kuò)增到巴爾通體枸櫞酸合酶(gltA)基因64份，陽(yáng)性率為15.84%，基因分析表明屬6種基因型；檢出伯氏疏螺旋體5S～23SrRNA間隔區(qū)基因5份，陽(yáng)性率為1.24%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示均為Borreliaafzelii型；檢出1例復(fù)合感染。其余病原體檢測(cè)均為陰性。結(jié)論滇西地區(qū)室內(nèi)小型獸類(lèi)感染病原體種類(lèi)多，分布廣，對(duì)人類(lèi)健康有一定的危害，需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)并采取預(yù)防控制措施。

滇西地區(qū)；居民區(qū)；小型獸類(lèi)；病原體

serum specimen was positive for plague F1 antibody. Sixty-fourgltAgene ofBartonellawas amplified by PCR and the positive rate was 15.84% (64/404). Gene analysis showed that 6 gene types forBartonellainfection were found. The 5S-23SrRNAgene ofBorreliaburgdorferiwas amplified by PCR and the positive rate was 1.24% (5/404). Phylogenetic tree showed that they wereBorreliaafzeliigene type. One small mammal tended to complex infection. Others were negative. In households of Western Yunnan Province, different types of pathogen infections exist in small mammals and there are potential hazard for human. Diseases surveillance should be strengthened and measures of control and prevention need to be implemented.

Supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81060229, 81360413, 81460485), the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry (No. 〔2011〕1568), the Yunnan Provincial Training Special Funds for High-level Health Technical Personnel (No. D-201249), the Yunnan Provincial Training of Youth Leader in Academic and Technical Reserve Talents (Nos. 2013HB080, 2014HB093), and the Dali University Doctoral Scientific Research Foundation (No. KYBS201302)

小型獸類(lèi)為小型哺乳動(dòng)物的統(tǒng)稱(chēng)，泛指嚙齒目(Rodentia)、食蟲(chóng)目(Insectivora)、攀鼩目(Scandentia)、兔形目(Lagomorpha)、翼手目(Chiroptera)以及食肉目(Carnivora)中的部分小型動(dòng)物。由于它們種類(lèi)繁多、分布廣泛、遷移性小、適應(yīng)性強(qiáng)，構(gòu)成了生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。部分種類(lèi)對(duì)人們的日常生活、農(nóng)田水利、林業(yè)、牧業(yè)等造成危害，有些小獸(尤其是嚙齒動(dòng)物)及其體表寄生蟲(chóng)還與人類(lèi)疾病相關(guān)，在病原體的長(zhǎng)期保存、疾病傳播和流行中具有重要意義[1-2]。云南省地處中國(guó)西南邊陲，動(dòng)植物資源異常豐富，尤其是滇西地區(qū)地理環(huán)境和氣候條件復(fù)雜多樣，從而孕育了自然疫源性疾病宿主動(dòng)物和媒介生物多樣性的特征。既往疫情發(fā)生和調(diào)查結(jié)果顯示，該區(qū)域是云南省多種自然疫源性疾病如鼠疫、腎綜合征出血熱、鉤端螺旋體病、巴爾通體等的高發(fā)地區(qū)[3-5]。而農(nóng)村居民區(qū)多與耕地、林地接壤或交匯，室內(nèi)常有小型獸類(lèi)分布，并與人類(lèi)密切接觸，其攜帶病原體易于傳播給人類(lèi)。因此有必要了解該區(qū)域小型獸類(lèi)病原體攜帶狀況，為疾病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究對(duì)滇西10縣、市20個(gè)自然村居民區(qū)室內(nèi)小型獸類(lèi)感染鼠疫、巴爾通體、伯氏疏螺旋體、巴貝西原蟲(chóng)、人粒細(xì)胞無(wú)形體、埃立克體、漢坦病毒等病原體的情況進(jìn)行調(diào)查研究。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本采集在滇西地區(qū)的8個(gè)州(市)抽取德欽、玉龍、蘭坪、永仁、祥云、南華、耿馬、云縣、芒市、隆陽(yáng)區(qū)10個(gè)縣(市、區(qū))，每個(gè)縣(市、區(qū))選擇4個(gè)自然村，對(duì)每個(gè)自然村的全部住戶(hù)進(jìn)行編號(hào)，根據(jù)編號(hào)隨機(jī)抽取20戶(hù)家庭，共計(jì)800個(gè)家庭進(jìn)行調(diào)查。詳細(xì)抽樣信息見(jiàn)表1，采樣區(qū)分布見(jiàn)圖1。以籠夜法進(jìn)行捕鼠，每戶(hù)放置5個(gè)鼠籠，連續(xù)放3夜，每天檢查。如有捕獲則更換新籠繼續(xù)放置。捕獲的動(dòng)物帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行種類(lèi)鑒定，股靜脈采集血液分離血清，無(wú)菌條件解剖取臟器組織材料。

圖1　調(diào)查采樣區(qū)分布Fig.1　Distribution of sampling area

1.2試劑與設(shè)備

1.2.1鼠疫免疫學(xué)檢測(cè)分別采用3種方法檢測(cè)鼠疫菌F1抗體和F1抗原。雙抗原和雙抗體夾心ELISA診斷試劑盒(ELISA法)由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，試劑盒批號(hào)20120101、20111202；間接血球凝集試驗(yàn)試劑盒(IHA、RIHA法)由吉林博德醫(yī)學(xué)免疫制品有限公司生產(chǎn)，試劑盒批號(hào)20130101、20130101；膠體金免疫層析(GICA法)試紙條由云南省地方病防治所自制，批號(hào)：201301、201201。

1.2.2分子生物學(xué)檢測(cè)血液組織DNA提取試劑盒(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)，組織RNA提取試劑(Trizol. Ambion)，2×Taq MasterMix(TakaRa)，100 bp ladder Marker(Biomed)，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3儀器設(shè)備高通量組織研磨儀(德國(guó)Retsch，MM400型)、水平電泳槽 JY-SPFT型、PCR儀(德國(guó)SENSO，LabCycler Gradient Fuses型)，凝膠成像分析儀(美國(guó)Syngene，G:Box)。酶標(biāo)檢測(cè)儀Anthos 2010型，自動(dòng)洗板機(jī)BIO-RAD 1575型。

表1樣本抽取資料

Tab.1Sample selection data

州(市)Prefecture(City)縣(市、區(qū))County(City)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))Township(Town)自然村Village家庭(戶(hù))Family(Household)大理州祥云縣普淜鎮(zhèn)必乍村、董家村80下莊鎮(zhèn)老張五村、小劉營(yíng)迪慶州德欽縣佛山鄉(xiāng)江坡村、溜筒江村80云嶺鄉(xiāng)斯農(nóng)布村、西當(dāng)村麗江市玉龍縣太安鎮(zhèn)吉子村、汝南村80黃山鎮(zhèn)金龍村、鹿子村楚雄州永仁縣維的鄉(xiāng)恩舊村、桃苴大村80永定鎮(zhèn)拉務(wù)么村、太平地大村南華縣沙橋鎮(zhèn)新建村、朱家屯村80雨露鄉(xiāng)果樂(lè)村、金家村保山市隆陽(yáng)區(qū)辛街鄉(xiāng)北村三組、柳樹(shù)壩村80板橋鎮(zhèn)馬家二組、趙家灣村德宏州芒 市芒市鎮(zhèn)芒晃村、偏窩村80遮放鎮(zhèn)街道三社、非海二社臨滄市云 縣漫灣鎮(zhèn)昔宜組、大溫竹村80曉街鄉(xiāng)老普組、新寨村耿馬縣賀派鄉(xiāng)芒嘎弄組、芒廣組80勐撒鎮(zhèn)半坡村、上細(xì)卡組怒江州蘭坪縣河西鄉(xiāng)大羊村、共興村80通甸鎮(zhèn)羅古箐村、清甸灣村Total102040800

1.3方法

1.3.1鼠疫免疫學(xué)檢測(cè)采用3種方法分別對(duì)血清作鼠疫F1抗體、臟器懸液上清作F1抗原檢測(cè)，試驗(yàn)方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，標(biāo)本處理參照《鼠疫防控應(yīng)急手冊(cè)》[6]。ELISA初篩陽(yáng)性者作驗(yàn)證試驗(yàn)，即用含F(xiàn)1抗原或抗體的稀釋液與用樣本稀釋液同時(shí)對(duì)平行檢測(cè)樣本，前者為驗(yàn)證列，后者為滴度列。當(dāng)驗(yàn)證列陽(yáng)性反應(yīng)孔數(shù)比滴度列低2孔或2孔以上為驗(yàn)證試驗(yàn)陽(yáng)性。被檢測(cè)孔A450(S)/陰性對(duì)照孔A450比值的平均值(N)≥2.1時(shí)(陰性孔A450值<0.1者，以0.1計(jì))的最高稀釋度作為滴度終點(diǎn)。GICA檢測(cè)以質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)均出現(xiàn)紫紅色帶判定為陽(yáng)性。IHA和RIHA采用V板法，初篩陽(yáng)性者作抑制試驗(yàn)，當(dāng)血凝抑制列呈陽(yáng)性“++”凝集的孔比血凝試驗(yàn)列少2孔及以上時(shí)，可判定為特異性凝集；以出現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)度“++”的最高稀釋度作為滴度終點(diǎn)。同一份樣品均用3種方法作平行檢測(cè)。

1.3.2分子生物學(xué)檢測(cè)取10 mg脾臟組織研磨后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步提取DNA。肺臟組織研磨后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步提取RNA。RNA采用M-MLV酶(美國(guó)，Promega)和引物P14逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別以DNA和cDNA為模板進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)。檢測(cè)病原名稱(chēng)、擴(kuò)增引物及條件等見(jiàn)表2. PCR產(chǎn)物用帶有Goldviev的1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀觀察結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立空白對(duì)照，為避免標(biāo)本污染所造成的假陽(yáng)性，DNA模板的提取、反應(yīng)體系的配制、模板的添加、PCR的擴(kuò)增均在不同的房間進(jìn)行。

1.3.3序列測(cè)定與分析PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司、北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具將測(cè)序結(jié)果與GenBank中注冊(cè)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。采用Lasergene軟件包的MegAlign程序進(jìn)行序列比對(duì)。應(yīng)用MEGA6.06軟件，鄰接法Neighbor-Joining，Kimura 2-parameter model，bootstrap 1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表2病原體核酸檢測(cè)所用引物和擴(kuò)增條件

Tab. 2Sequences of primers and conditions of PCR amplification for pathogen detection

目的病原體Targetpathogens擴(kuò)增目的基因Targetgenesamplified引物名稱(chēng)Primer核苷酸序列Nucleotidesequence(5'-3')擴(kuò)增條件(退火溫度/時(shí)間,延伸溫度/時(shí)間)Amplificationconditions(Annealingtemperature/time,Extensiontem-perature/time)產(chǎn)物長(zhǎng)度ProductLength(bp)伯氏疏螺旋體Borreliaburgdor-feri5S～23SrRNA間隔區(qū)基因Spacergene23S3CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC55℃/30s,72℃/30s41223SaTAAGCTGACTAATACTAATTACCC23S6TCCTAGGCATTCACCATA59℃/30s,72℃/30s25223S5CTGCGAGTTCGCGGGAGA巴貝西原蟲(chóng)Babesiosis18srRNAbvif1CAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACA53℃/30s,72℃/30s370bviprCAACCGTTCCTATTAACCATTAPrima-fCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCTAA55℃/30s,72℃/30s150Prima-rCGATAACGCAGAAATTCAACTACGAG巴爾通體BartonellagltABhCS781.pGGGGACCAGCTCATGGTGG50℃/30s,72℃/1min379BhCS1137.nAATGCAAAAAGAACAGTAAACA新發(fā)立克次體(外引物)NewRickett-sia(Outerprimer)16SrRNAEh-out1TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG55℃/30s,72℃/1min653Eh-out2CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC埃立克體(內(nèi)引物)Ehrlichia(Innerprimer)HME1CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT55℃/30s,72℃/1min389HME2TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTATHGA1GTCGAACGGATTATTCTTATAGCTTG55℃/30s,72℃/1min389HGA2TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAC人粒細(xì)胞無(wú)形體(內(nèi)引物)HumanGranulocyticAnaplasmosis(In-nerprimer)傳統(tǒng)立克次體(外引物)TraditionalRickettsia(outerprimer)groELGro-1AAGAAGGAGTGATAAC45℃/40s,72℃/40s649Gro-2ACTTCAGTAGCACC斑點(diǎn)熱、斑疹傷寒(內(nèi)引物)Spottedfever,Typhus(In-nerprimer)SF1GATAGAAGAAAAGCAATGATG56℃/35s,72℃/35S217SR2CAGCTATTTGAGATTTAATTTGTF1ATATATCACAGTACTTTGCAAC56℃/35s,72℃/35S364TR2GTTCCTAACTTAGATGTATCAT恙蟲(chóng)病東方體(內(nèi)引物)Orientiatsut-sugamushi(Innerprimer)漢坦病毒hantavirus逆轉(zhuǎn)錄引物Rt-pcrprimer外引物Outerprimer內(nèi)引物InterprimerP14HTN-LF1HTN-LR1HTN-LF2HTN-LR2TAGTAGTAGACTCCATGTAYGTBAGTGCWGATGCAACCADTCWGTYCCRTCATCTGCWGATGCHACIAARTGGTCGCRTCRTCWGARTGRTGDGCAA55℃/30s,72℃/30S55℃/30s,72℃/30S450378

2　結(jié)　果

2.1小型獸類(lèi)的組成與分布本次調(diào)查共捕獲小型獸類(lèi)421只，分屬于2目2科6屬9種，采集有效臟器標(biāo)本404份，其中黃胸鼠269份(66.58%)，小家鼠75份(18.56%)，褐家鼠23份(5.69%)，大足鼠23份(5.69%)，臭鼩鼱7份，齊氏姬鼠2份，短尾鼩2份，灰麝鼩2份，卡氏小鼠1份。見(jiàn)表3.因部分捕獲動(dòng)物解剖前死亡，采集有效血清標(biāo)本325份，其中黃胸鼠221份(68.0%)，小家鼠60份(18.46%)，褐家鼠18份(5.54%)，大足鼠19份(5.85%)，臭鼩鼱3份，齊氏姬鼠1份，灰麝鼩2份，卡氏小鼠1份。

表3臟器材料組成與分布情況

Tab. 3The composition and distribution of viscera materials

采樣點(diǎn)SamplingSites黃胸鼠Rattustanezumi褐家鼠Rattusnorvegicus小家鼠Musmusculus大足鼠Rattusnitidus臭鼩鼱Suncusmurinus齊氏姬鼠Apodemuschevrieri短尾鼩Anourosorexsquamipes灰麝鼩Crociduraattenuata卡氏小鼠Muscaroli合計(jì)Total德欽———16—————16玉龍162———————20蘭坪174—1—————22永仁42726————185祥云1715———————33南華36————————36隆陽(yáng)區(qū)23—————22—27芒市94————————100云縣37————————39耿馬25————————26合計(jì)26923752372221404

2.2鼠疫免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果404份鼠臟器經(jīng)研磨后，取上清進(jìn)行鼠疫F1抗原檢測(cè)，3種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性。325份血清樣本采用3種方法檢測(cè)鼠疫F1抗體，結(jié)果為：IHA均為陰性，GICA陽(yáng)性6份，陽(yáng)性樣本來(lái)自芒市鎮(zhèn)(1)、永仁縣(3)、隆陽(yáng)區(qū)(1)和南華縣(1)，宿主動(dòng)物為小家鼠(3)、黃胸鼠(3)。ELISA陽(yáng)性3份，均來(lái)自芒市鎮(zhèn)，宿主動(dòng)物為黃胸鼠(2)、臭鼩鼱(1)。其中芒市鎮(zhèn)一份黃胸鼠血清樣本GICA和ELISA兩種方法同時(shí)陽(yáng)性，抗體滴度為1∶320。

M:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；PC:陽(yáng)性對(duì)照；NC：空白對(duì)照?qǐng)D2　gltA基因片段的凝膠電泳圖Fig.2　Gel electrophoresis image of amplified gltA partial sequence

2.3巴爾通體枸櫞酸合酶(gltA)基因檢測(cè)結(jié)果共檢測(cè)出巴爾通體gltA基因陽(yáng)性65份，見(jiàn)圖2。經(jīng)測(cè)序分析，64份為巴爾通體序列，陽(yáng)性率為15.84%，僅黃胸鼠和褐家鼠檢出陽(yáng)性，黃胸鼠陽(yáng)性率最高(62/269，23.05%)，褐家鼠僅檢出2份(8.70%，2/23)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，2種鼠的陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異(χ2=1.781，P=0.1821)。從地域上看，在緯度稍高的德欽、玉龍、蘭坪、永仁、祥云、南華等6個(gè)縣僅檢出3份陽(yáng)性。檢出陽(yáng)性最多的芒市，該地也是鼠密度最高、黃胸鼠密度最高的地區(qū)?；趃ltA基因的262 bp序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示滇西地區(qū)至少存在6種基因型的巴爾通體。絕大多數(shù)毒株與B.tribocorum同源關(guān)系最近(A)，主要分布在芒市、云縣、耿馬、隆陽(yáng)區(qū)；11個(gè)毒株與B.queenslandensis擁有共同的進(jìn)化祖先，可能屬于B.queenslandensis型(B)，主要分布在耿馬、芒市、云縣、玉龍；2株(260和278)與B.elizabethae同源關(guān)系最近(C)，2個(gè)毒株(331和304)與B.rochalimae擁有共同的進(jìn)化祖先，屬于B.rochalimae型，另外還有2個(gè)可能的新型D、E。芒市毒株基因型較為復(fù)雜，6種均存在，以A群為主，2個(gè)可能的新型也分布于該地。詳見(jiàn)圖3。

圖3　基于巴爾通體基因gltA基因部分測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.3　Phylogenetic analysis based on partial gltA gene of Bartonella

2.4伯氏疏螺旋體5S～23SrRNA間隔區(qū)基因片段檢測(cè)結(jié)果404份脾臟提取DNA經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增，5份樣品擴(kuò)增到目的片段，陽(yáng)性率為1.24%。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。5份陽(yáng)性樣本分別來(lái)自祥云(3)、云縣(1)、蘭坪(1)，檢出小獸有黃胸鼠(3)、褐家鼠(1)、臭鼩鼱(1)。其中2份陽(yáng)性樣本成功測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中注冊(cè)的核苷酸序列進(jìn)行比較，檢出的伯氏疏螺旋體構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示均與Borreliaafzelii型同源性最高，但來(lái)自祥云的XiangYun29和來(lái)自蘭坪的LanPing420之間有一定差距(見(jiàn)圖4)。

M: DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；PC:陽(yáng)性對(duì)照；NC：空白對(duì)照?qǐng)D4　5S～23S rRNA基因間隔區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　PCR amplification of the 5S-23S rRNA gene spacer region

2.5其他檢測(cè)結(jié)果對(duì)404份小獸脾臟提取的DNA樣本，采用巢式PCR方法分別擴(kuò)增巴貝西原蟲(chóng)18srRNA，立克次體采用屬特異及種特異分型引物擴(kuò)增16srRNA和熱休克蛋白基因groEL，結(jié)果均未擴(kuò)增到目的片段。對(duì)183份小獸肺臟標(biāo)本提取的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseT ranscr iptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)檢測(cè)漢坦病毒核酸，結(jié)果均為陰性。

2.6復(fù)合感染情況上述多種病原的檢測(cè)，檢出1例伯氏疏螺旋體和巴爾通體復(fù)合感染，樣本來(lái)自祥云縣的一只褐家鼠。

3　討　論

云南省是自然疫源性疾病流行最為嚴(yán)重的省份之一，滇西地區(qū)由于特殊的地域特征和氣候條件，哺乳動(dòng)物非常豐富。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，此區(qū)域已知小獸就達(dá)到5目11科58屬187種(亞種)[4]。而小獸是多種自然疫源性疾病的重要傳染源，也是病原體和媒介昆蟲(chóng)的主要宿主。從而構(gòu)成了該地區(qū)自然疫源性疾病種類(lèi)多、疫情嚴(yán)重而復(fù)雜的形勢(shì)[3,5]：云南鼠疫歷史悠久，疫源地廣泛[7]，自1982年疫情復(fù)燃以來(lái)，鼠疫監(jiān)測(cè)縣及人間病例數(shù)為全國(guó)之冠。腎綜合征出血熱近幾年發(fā)病縣(市)不斷增多，疫源地范圍不斷擴(kuò)大[8-9]。巴爾通體呈高度流行態(tài)勢(shì)，并具有宿主多樣性及基因型別多樣性特征[10]。分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)證實(shí)存在人粒細(xì)胞無(wú)形體、埃立克體、巴貝西原蟲(chóng)、伯氏疏螺旋體等病原體[11-16]。

圖5　5S～23S rRNA間隔區(qū)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5　Phylogenetic analysis of the 5S-23S rRNA spacer regions

鼠疫是烈性傳染病，云南省存在家、野鼠鼠疫疫源地，宿主動(dòng)物的監(jiān)測(cè)是防治工作的重要內(nèi)容。本調(diào)查對(duì)捕獲的小獸臟器和血清標(biāo)本進(jìn)行了鼠疫F1抗原和F1抗體檢測(cè)，結(jié)果F1抗原均陰性，檢出F1抗體陽(yáng)性血清。其中1份來(lái)自芒市鎮(zhèn)的黃胸鼠血清GICA和ELISA兩種方法均陽(yáng)性，抗體滴度達(dá)1∶320，IHA陰性?？赡芘c前2種方法敏感性高有關(guān)[17]。該地是家鼠鼠疫疫源地，曾多次發(fā)生鼠間和人間鼠疫疫情，本次調(diào)查結(jié)果F1抗原檢測(cè)均陰性，表明暫無(wú)動(dòng)物間疫情發(fā)生。但該地具備了動(dòng)物間鼠疫流行前期的宿主動(dòng)物、媒介存在的3項(xiàng)預(yù)兆指標(biāo)[18]，加之主要宿主動(dòng)物黃胸鼠抗體低滴度陽(yáng)性血清的檢出，需引起高度重視。雖然近年我省鼠疫疫情處于相對(duì)靜息狀態(tài)，但近期多地宿主、媒介等調(diào)查指標(biāo)表明[19]有再度暴發(fā)的可能性。巴爾通體(Bartonellaspecies)是一種可通過(guò)吸血節(jié)肢動(dòng)物在脊椎動(dòng)物間傳播的病原微生物，人類(lèi)可能因與攜帶病原體的動(dòng)物接觸而感染或致病，引起的疾病譜較為廣泛。本次調(diào)查從6縣市檢出64份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為15.84%。黃胸鼠和褐家鼠檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為23.05%(62/269)和8.70%(2/23)。陽(yáng)性樣品經(jīng)測(cè)序后作同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們變異度較大，至少可以分為6種基因型，除了B.tribocorum、B.elizabethae、B.queenslandensis、B.rochalimae外還有2個(gè)可能的新型。因此這些地區(qū)人群受巴爾通體感染的風(fēng)險(xiǎn)較高。萊姆病(Lyme disease, LD)是一種由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)感染、經(jīng)攜帶病原體的蜱叮咬傳播的自然疫源性疾病。宿主動(dòng)物較多，包括鼠、兔、鳥(niǎo)等野生脊椎動(dòng)物及犬、馬、牛等家畜，鼠類(lèi)是重要的宿主動(dòng)物之一。本調(diào)查共從3個(gè)縣的3種小獸中檢出5份陽(yáng)性樣本，其中兩份測(cè)序結(jié)果分析，均屬于b.afzelii基因型，但其變異度較大。該區(qū)域宿主動(dòng)物感染的伯氏疏螺旋體、巴爾通體均存在基因多樣性的特點(diǎn)，這些基因型多與人類(lèi)致病性有關(guān)，并檢出1例巴爾通體和伯氏疏螺旋體復(fù)合感染的褐家鼠。立克次體、巴貝西原蟲(chóng)、漢坦病毒檢測(cè)均為陰性，可能與采樣點(diǎn)均在居民區(qū)、小獸種類(lèi)偏少、幾乎不攜帶媒介昆蟲(chóng)蜱有關(guān)。尤其是腎綜合征出血熱，褐家鼠是家鼠型出血熱的主要傳染源，既往調(diào)查祥云縣居民區(qū)褐家鼠、黃胸鼠陽(yáng)性率達(dá)6.25%、10.00%，但本次未檢出陽(yáng)性可能樣本采集后未放液氮，低溫保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)RNA發(fā)生降解，今后需多加注意。

小型獸類(lèi)尤其是嚙齒動(dòng)物是多種自然疫源性疾病的宿主動(dòng)物和媒介宿主，其分布廣泛，居民區(qū)活動(dòng)的鼠類(lèi)及其攜帶的病原體對(duì)人類(lèi)健康帶來(lái)的危害更大。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示滇西居民區(qū)小獸攜帶病原體種類(lèi)多，并有兩種病原體復(fù)合感染的情況，部分地區(qū)鼠密度、蚤指數(shù)偏高，需引起重視。同時(shí)，滇西地區(qū)是重要的鼠疫疫源地，在鼠疫防治工作中，疾病監(jiān)測(cè)和各級(jí)部門(mén)投入人力財(cái)力開(kāi)展的鼠疫防治聯(lián)防工作，不僅能有效預(yù)防烈性傳染病鼠疫，對(duì)多種自然疫源性疾病的防治、減少鼠害造成的經(jīng)濟(jì)損失同樣具有重要意義，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

(致謝：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所郝琴團(tuán)隊(duì)給予萊姆病檢測(cè)指導(dǎo)，云南省地方病防治所鐘佑宏、石麗媛、蘇麗瓊等同志參與了部分現(xiàn)場(chǎng)資料收集工作，以及參與此項(xiàng)工作的10縣(市、區(qū))疾病預(yù)防控制中心和鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院的同志及配合調(diào)查的所有個(gè)人和家庭。)

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Pathogen infection of small mammals from households in Western Yunnan Province

DU Chun-hong1, YIN Jia-xiang2, ZUO Shu-qing3, LI Dong-mei4,WANG Xiu-fang2, CHENG Xiao-ou2, LIU Zheng-xiang1, YANG Guang-can1

(1.YunnanInstituteforEndemicDiseasesControlandPrevention,Dali671000,China;2.SchoolofPublicHealth,DaliUniversity,Dali671000,China;3.BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,theStateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,Beijing100071,China;4.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

The situation of pathogen infection for small mammals from households in Western Yunnan Province was investigated to provide scientific basis for natural focal diseases control and prevention. Small mammals were captured in 800 households of 40 natural villages, 10 counties, 8 prefectures, in Western of Yunnan Province. DNA or RNA of specimen from small mammals were extracted and detected plague,Bartonella,Borreliaburgdorferi, BABEI West protozoa,Anaplasmaphagocytophilum,Ehrlichia, and Hantavirus with renal syndrome using PCR or other methods. Results showed that a total of 421 small mammals, belongs to 9 species, was captured. Of 404 viscera specimens and 325 serum specimens were collected, one

Western Yunnan Province; household; small mammal; pathogen infection

Yin Jia-xiang，Email: chinayjx@hotmail.com

尹家祥，Email: chinayjx@hotmail.com

1.云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理671000；2.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理671000；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京100071；4.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206

R378

A

1002-2694(2016)07-0623-09

2016-04-21；

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.007

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81060229, 81360413, 81460485)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(教外司留〔2011〕1568號(hào))；云南省高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)專(zhuān)項(xiàng)(D-201249)；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才、技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No.2013HB080，2014HB093)和大理學(xué)院博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目(KYBS201302)