豬源沙門氏菌的分離鑒定與耐藥性分析

王偉，張雙翔，周碧君，胡興義，張海文明，程振濤，王開(kāi)功*

(1．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2．貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025;3．貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

豬源沙門氏菌的分離鑒定與耐藥性分析

王偉1，2，張雙翔3，周碧君1，2，胡興義1，2，張海1，2文明1，2，程振濤1，2，王開(kāi)功1，2*

(1．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2．貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025;3．貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

對(duì)采自貴州省某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的57份腹瀉仔豬腸道樣本進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，并用藥敏紙片法對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果，共分離鑒定沙門氏菌20株;藥敏試驗(yàn)表明所鑒定沙門氏菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率從高到低依次是麥迪霉素、紅霉素、卡那霉素、慶大霉素和諾氟沙星，且均為多重耐藥株，耐藥種類達(dá)12種以上。研究結(jié)果對(duì)合理使用藥物控制仔豬沙門氏菌感染提供了理論依據(jù)。

仔豬腹瀉;沙門氏菌;分離鑒定;耐藥性

由于仔豬消化器官、免疫器官和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善，消化功能不健全、免疫力差、體溫調(diào)節(jié)機(jī)能差、抗寒能力低等，易受外界不良因素侵襲，仔豬患病率高，其中腹瀉是仔豬常發(fā)疾病，也是引起初生仔豬至斷奶保育仔豬死亡的主要原因［1，2］。仔豬沙門氏菌病又稱仔豬副傷寒［3，4］，常發(fā)于6月齡以下的仔豬，1～4月齡多發(fā)，臨床上可分為急性(敗血型)、亞急性和慢性3種類型，常引起較高死亡率，其中敗血型病死率達(dá)90%，慢性型病死率達(dá)25%～50%。本研究對(duì)腹瀉仔豬腸道樣本進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，并進(jìn)行抗生素的耐藥性檢測(cè)，為臨床診斷和抗生素的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料采集貴州省某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬腸內(nèi)容物57份，放入采集器，4℃保存。

1．2 主要試劑及藥品

1．2．1 試劑:血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SS瓊脂、腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1．2．2 藥敏紙片:青霉素(PEN)、哌拉西林(PIP)、氨芐西林(AMP)、紅霉素(ERY)、羅紅霉素(ROX)、麥迪霉素(Med)、頭孢他定(CAZ)、頭孢曲松(SCF)、頭孢哌酮(CRO)、氧氟沙星(OFL)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、丁胺卡那霉素(AMI)共15種獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。1．3方法

1．3．1 細(xì)菌的分離:無(wú)菌條件下將病料按照常規(guī)劃線分離細(xì)菌的方法接種于血平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～14 h后，挑取單菌落做純化培養(yǎng)，備用。

1．3．2 生化鑒定:從純培養(yǎng)物中挑取單菌落接種于血清肉湯中，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，革蘭氏染色，鏡檢，并按照伯杰氏生化鑒定手冊(cè)進(jìn)行生化鑒定。

1．3．3 鑒別培養(yǎng)基:將通過(guò)初步生化鑒定的細(xì)菌劃線于鑒別培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～14 h后觀察菌落形態(tài)。

1．3．4 革蘭氏染色:挑取血瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，劃線接種于新的血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，并做革蘭氏染色，鏡檢。

1．3．5 藥敏試驗(yàn):藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色沙門氏菌在血瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，呈現(xiàn)圓形、灰白色、微隆起、邊緣整齊、濕潤(rùn)菌落(見(jiàn)圖1);SS培養(yǎng)基上，菌落為黑色、整齊、濕潤(rùn)的小菌落(見(jiàn)圖2)。取純培養(yǎng)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，可見(jiàn)無(wú)莢膜、無(wú)芽胞、散在的革蘭氏陰性短桿菌(見(jiàn)圖3)。

圖1 沙門氏菌在鮮血瓊脂上菌落形態(tài)

2．2分離菌株生化鑒定結(jié)果分離的沙門氏菌均能發(fā)酵木糖、山梨醇，發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)氣，動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、硫化氫反應(yīng)陽(yáng)性，賴氨酸脫氫酶、枸櫞酸鹽、MR反應(yīng)陽(yáng)性，棉子糖、鳥(niǎo)氨酸脫氫酶、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原均為陰性，與沙門氏菌的生化特性一致(見(jiàn)表1)。通過(guò)對(duì)57例腸道樣品進(jìn)行初步鑒定，得到疑似20株為沙門氏菌，初篩分離率為35．1%。

圖2 沙門氏菌在SS瓊脂上菌落形態(tài)

圖3 革蘭氏陰性桿菌(1 000×)

表1

2．3 沙門氏菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)所鑒定的20株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，20株沙門氏菌對(duì)麥迪霉素高度耐藥，耐藥率為95%;對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率分別為:紅霉素90．0%、羅紅霉素90．0%、卡那霉素60．0%、慶大霉素55．0%、頭孢哌酮45．0%、諾氟沙星40．0%、丁胺卡那霉素40．0%、頭孢他啶30．0%、青霉素35．0%、頭孢曲松25．0%、氧氟沙星25．0%、氨芐西林20．0%、環(huán)丙沙星20．0%、哌拉西林15．0%。

2．4 沙門氏菌耐藥圖譜對(duì)所分離鑒定20株沙門氏菌建立多重耐藥圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，20株沙門氏菌分離株中1株(5．0%)耐5類藥，2株(10．0%)耐6類藥，2株(10．0%)耐7類藥，2株(10．0%)耐8類藥，1株(5．0%)耐9類藥，4株(20．0%)耐10類藥，5株(20．5%)耐11類藥，3株(15．0%)耐12類藥。

表220 株沙門氏菌分離株對(duì)15種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

圖4 沙門氏菌多重耐藥圖譜

3 討論

3．1 本次調(diào)查共分離鑒定沙門氏菌20株，分離率為35．1%。2015年，黃美州等［5］對(duì)甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與沙門氏菌混合感染引起仔豬嚴(yán)重腹瀉。近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境急劇惡化，豬群感染性腹瀉在全國(guó)各地頻繁暴發(fā)，尤其是仔豬腹瀉給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

3．2 對(duì)分離株進(jìn)行臨床常用藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥率高達(dá)90%以上，對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥率在50%左右。多重耐藥分析發(fā)現(xiàn)，分離株8重耐藥菌株最多，為19．2%，其他依次為12重、9重及7重耐藥。VaargaC等［6］檢測(cè)并比較了加拿大阿爾伯塔省922株豬源沙門菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥性，結(jié)果沒(méi)有1種菌耐第3代頭孢菌素和喹諾酮類藥物，28%的沙門氏菌耐2至多種抗菌藥物，這與本次試驗(yàn)結(jié)果差別較大。本次分離的沙門氏菌產(chǎn)生了對(duì)第三代頭孢菌素和喹諾酮類藥物耐藥的菌株。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，目前我省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)細(xì)菌耐藥譜正不斷擴(kuò)大，多重耐藥增多。隨著養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用和不規(guī)范使用，細(xì)菌在藥物的選擇性壓力下不斷發(fā)生變異，以適應(yīng)藥物環(huán)境，其中以多重耐藥和耐藥譜不斷擴(kuò)大最為常見(jiàn)［7］。通過(guò)對(duì)病原菌耐藥性的調(diào)查，推薦該場(chǎng)使用敏感性高的藥物對(duì)仔豬腹瀉進(jìn)行治療。

［1］白馬偉，李芳，張英，等．云南省蒙自市仔豬腹瀉致病性細(xì)菌病原分析［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2016(2):25－26．

［2］王繼春，金星方，陳建明，等．常熟地區(qū)豬高熱病細(xì)菌性病原分離與鑒定［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(5):154－156．

［3］朱琳．豬細(xì)菌性腹瀉的防治［J］．疾病防治，2012(6):53－54．

［4］朱玲云，鄭龍龍，畢峻龍，等．曲靖地區(qū)仔豬腹瀉細(xì)菌性病原的分離鑒定與耐藥性分析［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42(3):696－700．

［5］黃美州，劉永明，王慧．甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原的分離鑒定及其耐藥性分析［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24(12):35－39．

［6］Varega C，Rajie A，Me Fall M E，et al．Compration of antimicrobial resistance in generic Esch－erichia coli and Salmone．cultured from identical fecal sampels in finishing swine［J］．Can J Vet Res，2008，72(2):181－187．

［7］盧曉輝，杜少甫，張磊．豫北地區(qū)仔豬腹瀉病的調(diào)查及防控［J］．畜牧與獸醫(yī)，2016，48(2):141－142．

Isolation，Identification and Drug Resistance of Salmonella from Swine

Wang Wei1，2，Zhang Shuangxiang3，Zhou Bijun1，2，Hu Xingyi1，2，Zhang Hai1，2，Wen Ming1，2Cheng Zhentao1，2，Wang Kaigong1，2*
(1．College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;2．Institute of Animal Diseases，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3．Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550001，China)

Isolation and identification of Salmonella from 57 intestinal samples of diarrhea piglets collected from a large－scale pig farm in Guizhou province，and drug susceptibility was analyzed by drug sensitivity method．The results showed that the resistance rate of Salmonella to antimicrobial agents was from high to low in the order of aboren，erythromycin，kanamycin，gentamicin and norfloxacin，and are multi－drug resistant strains，resistant to more than 12 kinds of species．The results provided a theoretical basis for rational use of drugs to control Salmonella infection in piglets．

Piglet Diarrhea;Salmonella;Isolation;Drug Resistance

S858．28

A

1007－1474(2016)06－0001－04

2016－09－26

貴州省科學(xué)技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY［2015］3009－1號(hào));“貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”(黔科合人才團(tuán)隊(duì)［2015］401號(hào)6)

王偉(1990—)，男，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，在讀碩士研究生。E－mail:332087913@qq．com

*通訊作者:王開(kāi)功(1959—)，男，教授，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)的教學(xué)和科研工作。E－mail:kaigongwang@aliyun．com