“溫度對(duì)酶活性影響”實(shí)驗(yàn)的再探究

姚 舒

(首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100048) 張 勝 (廣東省深圳第三高級(jí)中學(xué) 518172)

1 實(shí)驗(yàn)背景

1.1 酶的概念 在一定條件下，酶在生物體內(nèi)或體外均可催化各種生化反應(yīng)。它與一般催化劑的共性在于：都是通過降低化學(xué)反應(yīng)的活化能而加速反應(yīng)進(jìn)行(圖1)；不能改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點(diǎn)；反應(yīng)前后酶的質(zhì)量、性質(zhì)不變[1]。

1.2 溫度與酶催化反應(yīng)的關(guān)系 酶催化底物反應(yīng)以效應(yīng)物與酶活性有關(guān)基團(tuán)的碰撞—絡(luò)合—解離為基礎(chǔ)。從熱力學(xué)的角度看，對(duì)于一個(gè)酶分子而言，只存在 “有活性”與“無活性”兩種狀態(tài)，不具有連續(xù)性。只有當(dāng)酶成為一個(gè)“ 群體”時(shí)，因受溫度與pH的影響，有些酶失活，有些酶仍有活性，才表現(xiàn)出來酶“群體”活性隨溫度或pH 變化的連續(xù)曲線[2]。酶的最適溫度并非酶的特征常數(shù)，并不固定，而與測(cè)定酶活力的時(shí)間長短有關(guān)，因?yàn)槊缚梢远虝r(shí)間內(nèi)耐受較高的溫度。大多酶在40℃以上催化活力下降；60℃～70℃呈現(xiàn)可逆失活；70℃～80℃出現(xiàn)不可逆失活[1]。酶的變性有兩方面的原因：溫度和時(shí)間。在高溫下變性比較快，但在較低溫度下，變性也會(huì)緩慢發(fā)生[3]。在一般情況下，溫度對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)中將自變量設(shè)定為溫度，由于時(shí)間較短，不考慮時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來的影響。

圖1 酶催化機(jī)理——降低反應(yīng)所需活化能

2 實(shí)驗(yàn)常見問題及改進(jìn)

2.1 實(shí)驗(yàn)原理不合理 在碘-淀粉溶液中，由于配合與吸附作用產(chǎn)生了藍(lán)色的淀粉—碘包合物。但是，當(dāng)溶液溫度升高時(shí)，淀粉的螺旋構(gòu)象會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致無法繼續(xù)保持與碘的吸附狀態(tài)，藍(lán)色因此褪去[4]。因此，碘液不可在高溫下檢測(cè)淀粉。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程的改進(jìn) 用列表顯示操作步驟會(huì)使學(xué)生一目了然，并在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)一步驗(yàn)證低溫、高溫對(duì)酶活性的影響。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的再設(shè)計(jì)，可使學(xué)生實(shí)驗(yàn)的成功率大大提高，并更為直觀地驗(yàn)證酶的性質(zhì)，豐富實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容[5]。另外，底物淀粉和酶必須保存在同一溫度中，防止淀粉和酶混合在一起溫度突然發(fā)生變化，影響在冰浴和沸水浴中唾液淀粉酶的活性[6]。

2.3 新方法的嘗試 有研究者嘗試運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)反應(yīng)后的樣本進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，來探究溫度對(duì)酶活性的影響。由于蛋白酶活性在不同溫度和時(shí)間下強(qiáng)弱不同，使得底物蛋白被切割的條帶在聚丙烯酰胺凝膠上顯示的粗細(xì)不同，據(jù)此可以判斷酶活性的強(qiáng)弱[7]。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中涉及的幾種實(shí)驗(yàn)材料對(duì)于普通中學(xué)來說不容易獲得，且凝膠電泳裝置也并不常見，因此不適宜推廣。

3 溫度對(duì)酶活性影響的再探究

參考美國主流生物學(xué)教材《生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[8]，采用兒茶酚溶液替代淀粉溶液設(shè)計(jì)探究實(shí)驗(yàn)。

3.1 實(shí)驗(yàn)原理 兒茶酚氧化酶從土豆提取液中獲得。由于兒茶酚溶液為無色，苯醌為棕色，通過觀察顏色變化來定性判斷反應(yīng)進(jìn)行的程度。同時(shí)，顏色的逐漸變化可利用吸光度定量得出。

3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 準(zhǔn)備1%兒茶酚溶液、土豆提取液、冰箱、水浴鍋、試管架、試管。實(shí)驗(yàn)過程如下：

(1)在40℃和80℃的水浴鍋水浴或室溫下以及4℃冰箱中放置1個(gè)試管架。

(2)取7支試管，并在試管上部依次編號(hào)1～7。

(3)取1管馬鈴薯提取液和1管1%兒茶酚溶液。

(4)如表1所示，將蒸餾水，pH緩沖液和馬鈴薯提取物添加到試管中，震蕩馬鈴薯提取液至懸浮狀態(tài)。

(5)將上述試管放在對(duì)應(yīng)溫度的水浴或冰箱里，每支管在各自對(duì)應(yīng)的溫度下靜置5 min預(yù)熱(預(yù)冷)。將1至4號(hào)試管放到試管架置于室溫環(huán)境中(約22℃)或者20℃的水浴鍋中。

(6)如表1所示，向2號(hào)以及4～7號(hào)試管添加1%兒茶酚溶液。立即記錄每支試管此時(shí)的顏色變化，并在表1中記錄。定性記錄顏色變化，范圍從0～5，0表示沒有顏色變化，5表示劇烈變化。

(7)在接下來的20 min，每隔5 min觀察記錄一次顏色的變化，每次觀察完要迅速將試管放回原來的位置(冰箱或水浴)。

(8)實(shí)驗(yàn)完畢后，清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)和實(shí)驗(yàn)材料，兒茶酚必須倒入專門的廢棄物容器中，不能直接倒入水池。

4 實(shí)驗(yàn)討論

從表1可見，試管1和3不含底物，試管2雖然有底物，不含酶。因此，試管1、2、3不會(huì)發(fā)生變化，保持原來的透明無色不變；試管4、5、6、7中的底物和酶完全相同，溫度為自變量。兒茶酚氧化酶對(duì)溫度敏感，最適溫度為15℃，到45℃就完全失活。也有文獻(xiàn)報(bào)道22℃為兒茶酚氧化酶的最適溫度[9]，反應(yīng)條件可能有所差異。需要注意的是，在加入兒茶酚氧化酶之前需提前預(yù)熱反應(yīng)系統(tǒng)到設(shè)定溫度，減少酶加入之后還未達(dá)到預(yù)設(shè)溫度從而產(chǎn)生誤差。