羅丹明B純度標準物質(zhì)的研制*

周瑾艷，陳玲，毛沅文，周陽，尹強，許俊斌（廣東省計量科學研究院，廣州 510405）

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羅丹明B純度標準物質(zhì)的研制*

周瑾艷，陳玲，毛沅文，周陽，尹強，許俊斌
（廣東省計量科學研究院，廣州 510405）

以商購羅丹明B為原料，進行重結晶提純，制備羅丹明B純度標準物質(zhì)。采用紅外光譜（IR）、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜（NMR）進行定性分析。樣品分裝400瓶后，依據(jù)國家《一級標準物質(zhì)研制技術規(guī)范》，采用液相色譜-二極管陣列法對隨機抽取的15瓶樣品進行均勻性檢驗，經(jīng)F檢驗表明，在95%的置信區(qū)間范圍內(nèi)，樣品均勻性良好。在室溫下，經(jīng)過30個月穩(wěn)定性考察，結果表明樣品穩(wěn)定性良好。標準物質(zhì)經(jīng)國內(nèi)8家具有分析資質(zhì)的實驗室進行協(xié)同定值，定值結果為99.0%，擴展不確定度為1.0%（k=2）。該標準物質(zhì)達到了國家標準物質(zhì)的技術要求，可用于有關羅丹明B的分析方法校正和質(zhì)量控制。

羅丹明B；標準物質(zhì)；純度；重結晶；不確定度

目前食品安全問題已成為全社會關注的熱點和焦點。許多食品安全問題與食品添加劑的使用不當有關，如超出范圍、超量使用或非法使用食品添加劑。食用色素是用來著色的食品添加劑［1-3］。隨著食用色素安全性實驗技術的發(fā)展，有的合成色素有致癌作用，能誘發(fā)染色體變異。2003年沸沸揚揚的“蘇丹紅”風暴引起了全世界對色素安全的關注，2005年質(zhì)檢總局查出不法分子用羅丹明B替代蘇丹紅制出毒花椒和火鍋底料。

羅丹明B（Rhodamine B）又稱玫瑰紅B，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料。經(jīng)老鼠試驗發(fā)現(xiàn)，羅丹明B會引致皮下組織生肉瘤，被懷疑是致癌物質(zhì)，國家已經(jīng)明令禁止在食品中使用。目前行業(yè)內(nèi)大都使用國外進口的羅丹明B標準品，德國Dr. Ehrenstorfer Gmb H和美國Accustandard?分別研制了羅丹明B的純度標準物質(zhì)和溶液標準物質(zhì)。但這些標準物質(zhì)通常價格昂貴，且采購周期長。我國關于羅丹明B有證標準物質(zhì)的研制還未見報道。因此基于食品安全的需求和保障國家食品安全溯源體系，筆者研制了羅丹明B有證標準物質(zhì)，為食品安全檢測和監(jiān)督管理提供重要技術支撐。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695-2998型，美國Waters 公司；

傅里葉紅外光譜儀：Tensor-37 型，德國布魯克公司；

核磁共振儀：DPX-300 型，美國Bruker公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Agilent 6540 Q-TOF 型，美國安捷倫科技公司；

羅丹明B原料：純度大于95%，市購；

甲醇：色譜級，德國Merck公司；

實驗所用其它試劑均為分析純；

實驗用水為超純水。

1.2羅丹明B標準樣品的制備

采用高純羅丹明B為原料，以甲醇-水（體積比為5∶1）為溶劑，在電熱板上加熱至80℃使其溶解后，再分次加入適量甲醇和水（甲醇和水的用量比為1∶1），保溫20 min，濾過，4℃條件下重結晶5 h，過濾后干燥，經(jīng)研磨過篩，混勻后得羅丹明B候選標準物質(zhì)。將純化后的羅丹明B純度樣品分裝于棕色玻璃樣品瓶，每瓶200 mg，共分裝約400瓶。封裝好的樣品，放置于4℃冰箱保存。

1.3定性分析

采用紅外光譜、核磁H譜和高分辨質(zhì)譜對羅丹明B標準物質(zhì)主成分進行定性分析。

1.4定值分析

羅丹明B標準物質(zhì)純度采用液相色譜法［4-6］進行測定。

1.4.1儀器工作條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：甲醇；波長：545 nm；流量：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：35℃。

1.4.2樣品配制

隨機抽取分裝好的羅丹明B標準物質(zhì)，準確稱取100 mg，用甲醇稀釋至100 mL容量瓶，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，用液相色譜法進行純度檢測，每次進樣10 μL，每個樣品重復進樣3次。

2　結果與討論

2.1定性分析

采用紅外光譜、核磁H譜對研制的羅丹明B標準物質(zhì)主成分進行定性分析。圖1、圖2分別為研制的羅丹明B純度標準物質(zhì)的紅外譜圖和SDBS圖庫中羅丹明B標準紅外譜圖。圖3、圖4分別為研制的羅丹明B純度標準物質(zhì)的核磁H譜圖和SDBS圖庫中羅丹明B的核磁H譜圖。由圖1、圖2可知，純化后羅丹明B的紅外譜圖與標準譜圖相符，判斷主成分為羅丹明B；由圖3、圖4可知，純化后羅丹明B核磁共振H譜圖與標準H譜圖相符，說明該純度物質(zhì)與羅丹明B結構一致。

圖1　研制的羅丹明B純度標準物質(zhì)的紅外譜圖

圖2　SDBS圖庫中羅丹明B標準紅外譜圖

圖3　羅丹明B純度標準物質(zhì)的核磁共振H譜圖

圖4　SDBS圖中的羅丹明B標準核磁H譜圖

2.2均勻性檢驗

標準物質(zhì)的均勻性是衡量標準物質(zhì)性能的一項重要指標，也是標準物質(zhì)量值準確傳遞的基礎。采用方差分析法來統(tǒng)計檢驗所研制的標準物質(zhì)的均勻性。參照標準物質(zhì)技術規(guī)范，分別從已經(jīng)分裝好的400瓶羅丹明B純度樣品中按照頭尾、中間編號各隨機抽取15瓶樣品。準確稱量抽取的樣品約10 mg，配制成溶液，采用液相色譜-面積歸一化法測定純度，每瓶樣品平行進樣3次，以每次測量的平均值作為均勻性評價結果，然后對其進行方差分析，結果列于表1、表2。

表1　羅丹明B純度標準物質(zhì)均勻性檢驗結果 %

查表得Fα=2.037，經(jīng)計算F=0.658，F(xiàn)

2.3穩(wěn)定性檢驗

依據(jù)標準物質(zhì)技術規(guī)范，按照前緊后疏的原則，對羅丹明B純度標準物質(zhì)進行了30個月的長期穩(wěn)定性考察，結果見表3。另外對短期穩(wěn)定性進行了考察，短期穩(wěn)定性是指標準物質(zhì)在運輸過程中的穩(wěn)定性。為了考察運輸條件對標準物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，并綜合考慮到南方的高溫天氣，模擬運輸條件，隨機抽取6瓶樣品，置于運輸條件下（60℃±5℃，培養(yǎng)箱中）和常規(guī)儲存條件下（4℃±1℃），考察其短期穩(wěn)定性，結果表4。

表3　羅丹明B純度標準物質(zhì)長期穩(wěn)定性試驗結果

表4　羅丹明B標準物質(zhì)短期穩(wěn)定性試驗結果

采用直線模型作為經(jīng)驗模型，對羅丹明B長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進行分析［7］，計算得斜率斜率不顯著，即表明在30個月內(nèi)羅丹明純度標準物質(zhì)的量值沒有發(fā)生明顯的趨勢性變化。同時對兩種條件下的測量數(shù)據(jù)進行同樣的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)儲存條件和運輸條件下羅丹明B標準物質(zhì)的穩(wěn)定性均良好。

2.4定值結果與不確定度

2.4.1定值結果

（1）羅丹明B純度標準物質(zhì)的原料經(jīng)重結晶提純，按照“國家一級標準物質(zhì)技術規(guī)范”的要求，主成分純度采用8家實驗室合作定值，所采用的定值方法為液相色譜面積歸一化法［7-11］。8家實驗室定值的分析結果見表5。

表5　羅丹明B純度標準物質(zhì)定值結果 %

采用狄克遜準則和格拉布斯準則［12-13］對所有數(shù)據(jù)進行可疑值分析，結果表明未發(fā)現(xiàn)可疑值。因此采用8家實驗室的總平均值作為聯(lián)合定值的結果。

采用液相色譜-面積歸一化法測定羅丹明B的純度，其結果不包含標準物質(zhì)的水分和殘渣，因此需要對其水分和殘渣進行測試。

（2）水分測試。水分測試采用卡爾費休水分測定儀，重復測量6次，取平均值作為水分測試結果，得到羅丹明B純度標準物質(zhì)水分含量為0.17%。

（3）殘渣測試。殘渣分析通過高溫灼燒測得。稱取適量樣品，在（650±50）℃的馬弗爐中灼燒至恒重進行稱量，重復測量6次，取平均值得到羅丹明B純度標準物質(zhì)殘渣含量為0.34%。

（4）定值結果。根據(jù)多家實驗室液相色譜法定值結果及樣品水分和殘渣的測定值，羅丹明B的純度：

2.4.2定值結果的不確定度評定

根據(jù)JJG 1006-1994 《一級標準物質(zhì)技術規(guī)范》及標準物質(zhì)定值的相關規(guī)定［4-7］，標準值定值結果的不確定度由3部分組成：羅丹明B定值實驗引入的不確定度u定值；樣品不均勻引入的不確定度u均；樣品不穩(wěn)定性引入的不確定度u穩(wěn)。依據(jù)實驗測量結果，計算出羅丹明B標準物質(zhì)的特性標準值和不確定度分量，各不確定度分量見表6。

表6　定值不確定度分量評定結果

根據(jù)表6，合成不確定度：

取包含因子k=2，則擴展不確定度：

羅丹明B純度標準物質(zhì)的定值結果：

3　結論

研制的羅丹明B純度標準物質(zhì)經(jīng)過了均勻性、穩(wěn)定性考察，采用多家實驗室對其進行聯(lián)合定值，定值結果準確可靠。該標準物質(zhì)的研制可滿足食品、藥品、日化、環(huán)境保護及化工產(chǎn)品的檢測需要，可用于相關儀器（色譜儀）的校準、分析方法評價，為統(tǒng)一相關量值發(fā)揮作用。

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Development of Rhodamine B Certified Reference Material

Zhou Jinyan， Chen Ling， Mao Yuanwen， Zhou Yang， Yin Qiang， Xu Junbin
（Guangdong Institute of Metrology， Guangzhou 510405， China）

Rhodamine B certified reference material was developed. Raw material was recrystallized for preparation of Rhodamine B by business purchased. The structure of Rhodamine B certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy （IR），high resolution mass spectral and nuclear magnetic resonance （NMR）. The homogeneity testing were evaluated by liquid chromatography with diode array detector detector （LC-DAD）. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 400 bottles，and the results were validated by F-test statistical method. The test results indicated that the homogeneity was good in the 95% confidence interval. The stability inspection was carried at room temperature for 30 months. The results indicated that the stability was good. A cooperative certification was conducted by eight qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of Rhodamine B was 99.0% with relative expaned uncertainty of 1.0%（k=2）. The reference material can meet the technical requirement of the certified reference material， it can be used for the method validation and quality control regarding Rhodamine B.

Rhodamine B； certified reference material； purity； recrystallization； uncertainty

O657

A

1008-6145（2016）04-0004-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.001

*廣東省質(zhì)量技術監(jiān)督局科技計劃項目（2013ZJ02）

聯(lián)系人：周瑾艷；E-mail: zhoujinyan2005@163.com

2016-05-17