共刺激分子CD80和CD86表達對鼻咽癌進展及預后的影響研究

蔡曼波，馮啟勝，陳麗珍，邵建永，曾益新

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·論著·

共刺激分子CD80和CD86表達對鼻咽癌進展及預后的影響研究

蔡曼波，馮啟勝，陳麗珍，邵建永，曾益新

背景CD80和CD86是T淋巴細胞活化的重要共刺激分子，腫瘤細胞可通過低表達或缺失共刺激分子發(fā)生免疫逃逸。目的探討共刺激分子CD80和CD86表達對鼻咽癌進展和預后的影響。方法選取2001年1月—2003年12月經(jīng)中山大學腫瘤防治中心病理科診斷為鼻咽癌并有相應臨床隨訪資料的鼻咽癌組織標本557例。患者均初次診斷且未進行任何治療，隨訪時間2～114個月，隨訪過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移113例，死亡235例。采用免疫組織化學法檢測CD80和CD86表達，采用Kaplan-Meier生存曲線、Log-rank檢驗及單因素Cox比例風險回歸分析探討CD80和CD86表達與鼻咽癌患者進展及預后的關系。結果免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)，CD80和CD86主要定位在細胞膜上，在腫瘤間質(zhì)很少表達。557例患者中CD80低表達組309例，CD80高表達組248例；CD86低表達組470例，CD86高表達組87例。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗結果顯示，CD80低表達組與CD80高表達組鼻咽癌患者無瘤生存時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.551，P=0.060)；CD80低表達組與CD80高表達組鼻咽癌患者總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.521，P=0.019)。CD86低表達組與CD86高表達組鼻咽癌患者無瘤生存時間及總生存時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.948，P=0.330；χ2=0.662，P=0.416)。單因素Cox比例風險回歸分析結果顯示，CD80高表達組鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險高于CD80低表達組(P<0.05)；CD86低表達組與CD86高表達組鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Spearman秩相關分析結果顯示，鼻咽癌組織中CD86表達與間質(zhì)中CD68+巨噬細胞數(shù)量呈正相關(rs=0.103，P=0.015)。結論鼻咽癌組織中CD80高表達與鼻咽癌患者預后差有關，增加局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移風險；未發(fā)現(xiàn)CD86表達與鼻咽癌患者進展及預后相關。

鼻咽腫瘤；抗原，CD80；抗原，CD86；預后

蔡曼波，馮啟勝，陳麗珍，等.共刺激分子CD80和CD86表達對鼻咽癌進展及預后的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(22)：2686-2690.[www.chinagp.net]

CAI M B,FENG Q S,CHEN L Z,et al.Influence of CD80and CD86expression on progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J].Chinese General Practice，2016，19(22)：2686-2690.

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤的生長和進展中發(fā)揮非常重要的作用[1-2]。在人體的抗腫瘤免疫機制中，T淋巴細胞介導的細胞免疫是主要方式。初始T淋巴細胞的活化既需要由T淋巴細胞抗原受體(TCR)與抗原提呈細胞(APC)上的抗原肽-主要組織相容性復合體(MHC)分子復合物結合提供的第一信號，又需要由APC上的協(xié)同刺激分子與T淋巴細胞上的相應配體結合提供的第二信號協(xié)同刺激[3]，CD80和CD86是T淋巴細胞活化的重要共刺激分子，其在腫瘤免疫以及腫瘤治療中的作用備受關注[4]。研究鼻咽癌組織中CD80和CD86的表達對鼻咽癌進展和預后的作用，有助于更深入探究腫瘤免疫微環(huán)境對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用及機制，并為其治療提供新的治療策略。本研究制作鼻咽癌組織芯片并進行免疫組織化學染色，觀察CD80和CD86在鼻咽癌組織中的表達情況及其表達與鼻咽癌進展及預后的關系。

1　材料與方法

1.1標本來源選取2001年1月—2003年12月經(jīng)中山大學腫瘤防治中心病理科診斷為鼻咽癌并有相應臨床隨訪資料的鼻咽癌組織標本557例。入選條件：(1)所收集蠟塊均為患者首次就診診斷為鼻咽癌的活檢標本。(2)觀察蘇木精-伊紅(HE)染色切片，選擇癌巢較大的鼻咽癌石蠟標本。(3)有完整臨床隨訪資料。(4)死于其他疾病(非鼻咽癌)或意外死亡的患者被剔除。557例患者中，男418例，女139例；年齡19～78歲，中位年齡46歲；依據(jù)1992年中國鼻咽癌分期系統(tǒng)[5]進行臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期148例，Ⅲ～Ⅳ期409例；依據(jù)WHO分型[6]將患者分為角化型癌(WHOⅠ型)16例，分化型非角化性癌(WHO Ⅱ型)139例，未分化型非角化性癌(WHO Ⅲ型)402例。隨訪時間2～114個月，隨訪過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移113例，死亡235例。

1.2免疫組織化學法

1.2.1試劑與材料CD80和CD86免疫組織化學抗體購自 Santa Cruz公司，抗原修復液(10 mmol/L枸櫞酸鈉溶液，pH 6.0)、油性筆(用于免疫組織化學)購于Sigma公司，辣根過氧化酶標記二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購于Dako公司；硅化載玻片購于廣州潔利生物醫(yī)學有限公司。

1.2.2免疫組織化學法CD80和CD86表達水平采用免疫組織化學SP法檢測。將組織芯片置入56 ℃恒溫箱，烘片30～60 min，將組織芯片取出后，常規(guī)脫蠟、脫水；3%過氧化氫(H2O2)消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原修復后，一抗(CD80：1∶500，CD86：1∶600)孵育，4 ℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗后，滴加足以覆蓋整張組織芯片的DAB顯色液，顯微鏡下控制染色深度；自來水終止顯色，鹽酸乙醇分化，蘇木精復染，晾干或吹干后中性樹膠封固。

1.2.3免疫組織化學結果判斷免疫組織化學結果判定采用雙盲法，由3名對病例資料完全不知情的病理醫(yī)生對結果進行判定，根據(jù)腫瘤細胞陽性染色強度計為3分(黃褐色)、2分(黃色)、1分(淡黃色)、0分(陰性)；根據(jù)陽性腫瘤細胞數(shù)量計為4分(>75%)、3分(51%～75%)、2分(26%～50%)、1分(5%～25%)、0分(<5%)。兩種計分相加之和為各檢測指標的表達狀況。參照既往研究方法[7-8]，以受試者工作特征(ROC)曲線建立的cut off值為臨界值，將CD80和CD86表達分為高/低表達組，CD86的cut off值為3.5，CD86的cut off值為1.5。

1.3CD68+巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量計算參照既往研究方法[7，9]計算CD68+巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量，在400倍高倍顯微鏡下，隨機觀察5個不重復且具代表性的視野，計數(shù)每個視野中陽性細胞個數(shù)，取其平均值。因調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在癌巢中浸潤極少，故本研究未統(tǒng)計癌巢中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的數(shù)量。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較采用Log-rank檢驗；采用單因素Cox比例風險回歸分析探討CD80和CD86表達對鼻咽癌進展和預后的影響，并計算風險比(hazard ratio，HR)和95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)；相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1CD80和CD86在鼻咽癌組織中的表達情況免疫組織化學法顯示，CD80和CD86主要定位在細胞膜上，在腫瘤間質(zhì)很少表達(見圖1)。

2.2CD80和CD86表達對鼻咽癌患者進展及預后的影響557例患者中CD80低表達組309例，CD80高表達組248例；CD86低表達組470例，CD86高表達組87例。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗結果顯示，CD80低表達組與CD80高表達組鼻咽癌患者無瘤生存時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.551，P=0.060)；CD80低表達組與CD80高表達組鼻咽癌患者總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.521，P=0.019，見圖2)。CD86低表達組與CD86高表達組鼻咽癌患者無瘤生存時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.948，P=0.330)；CD86低表達組與CD86高表達組鼻咽癌患者總生存時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.662，P=0.416，見圖3)。

單因素Cox比例風險回歸分析結果顯示，CD80高表達組鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險高于CD80低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。CD86低表達組與CD86高表達組鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

表1　CD80表達對鼻咽癌進展和預后的影響單因素Cox比例風險回歸分析

注：-為無此項數(shù)據(jù)；HR=風險比，CI=置信區(qū)間

圖1　CD80和CD86在鼻咽癌組織中的表達(免疫組織化學染色)

圖2　CD80低表達組與CD80高表達組鼻咽癌患者無瘤生存時間、總生存時間比較

組別例數(shù)無瘤生存率(%)HR值95%CIP值總生存率(%)HR值95%CIP值CD86低表達組47059.9參考--67.8參考--CD86高表達組8766.70.802(0.535,1.201)0.28473.60.834(0.538,1.294)0.418

注：-為無此項數(shù)據(jù)

2.3鼻咽癌組織中CD80和CD86表達與CD68+巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量的相關性Spearman秩相關分析結果顯示，鼻咽癌組織中CD80表達與癌巢及間質(zhì)中CD68+巨噬細胞、間質(zhì)中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量均無直線相關性(rs值分別為-0.042、-0.018、0.049，P值分別為0.325、0.670、0.245)。鼻咽癌組織中CD86表達與癌巢中CD68+巨噬細胞、間質(zhì)中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量均無直線相關性(rs值分別為-0.034、-0.025，P值分別為0.425、0.561)；鼻咽癌組織中CD86表達與間質(zhì)中CD68+巨噬細胞數(shù)量呈直線正相關(rs=0.103，P=0.015)。

3　討論

鼻咽癌是在中國華南地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，與EB病毒(EBV)感染相關，其腫瘤組織局部存在大量淋巴細胞和其他免疫細胞浸潤[7-8]。由癌細胞和間質(zhì)(免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等)共同組成的組織微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起主要作用[10]。免疫微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境有機整體的重要組成部分被視為腫瘤的“第七大標記性特征”，其所起作用越來越受到重視[10-11]。T淋巴細胞介導的特異性細胞免疫應答具有重要的抗腫瘤作用，共刺激分子在T淋巴細胞功能發(fā)揮中起重要作用。

B7分子是T淋巴細胞最重要的共刺激分子，包括B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，CD80與相應配體CD28的結合能誘導T淋巴細胞活化并增殖，與細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)結合下調(diào)免疫應答。CD80與CD86在氨基酸水平上有25%的同源性[12]。CD80主要表達在B淋巴細胞、激活的單核細胞、樹突細胞、激活的T淋巴細胞及樹突細胞表面。CD86是參與初次B淋巴細胞應答的主要共刺激分子，同時還有信號傳導功能[13]。研究提示，腫瘤組織一般不表達(或僅低表達)B7分子，從而難以誘導腫瘤特異性免疫應答[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞膜中，CD80表達明顯下調(diào)，其表達下調(diào)與腫瘤的惡性程度呈負相關，而 CD86表達卻未見下調(diào)[15]。而人B淋巴細胞淋巴瘤細胞膜天然高表達CD80和CD86分子，且與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移密切相關[16]。在食管癌腫瘤細胞中，CD80和 CD86的表達主要在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi),但在細胞膜未見有CD80和CD86的表達[17]，CD80高表達的食管癌患者預后好[18]。由此可見，在不同的腫瘤中，CD80和CD86的表達部位、表達情況及意義并不一致。

本研究中，CD80和CD86主要表達于鼻咽癌腫瘤細胞膜上，間質(zhì)細胞較少表達。CD80高表達組鼻咽癌患者總生存時間短于CD80低表達組，CD80高表達組鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)及死亡的風險高于CD80低表達組。結果提示，CD80高表達的鼻咽癌患者預后差，這與在B淋巴細胞淋巴瘤中報道一致[16]。B7分子只有在細胞膜上表達,才能與 T淋巴細胞上的CD28 分子結合，激活 T 淋巴細胞,發(fā)揮免疫效應。晶體結構顯示，CD80的C區(qū)的特異氨基酸能更好的與CTLA4結合，CD80是CTLA4的重要配體介導下調(diào)Th1應答及CD8+T淋巴細胞的活化[19]。相反，CD86在Th2細胞因子介導的免疫應答中，對于促進初始CD4+T淋巴細胞的活化具有重要的作用[20]。在體外阻斷CD86能夠抑制CD4+T淋巴細胞的活化，而CD80的阻斷則加強CD8+T淋巴細胞的活化及細胞毒T淋巴細胞(CTL)的效應功能[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD80人-鼠嵌合抗體能顯著抑制惡性B淋巴瘤細胞株的體外增殖，CD86主要與CD28結合而激活T淋巴細胞免疫反應[22]。研究鼻咽癌組織中CD80和CD86的表達情況及意義有助于更好地了解共刺激分子在腫瘤組織中的作用，為腫瘤的免疫治療提供新的靶點。

綜上所述，鼻咽癌組織中CD80高表達與鼻咽癌患者預后差有關，增加局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移風險，未發(fā)現(xiàn)CD86表達與鼻咽癌患者進展及預后相關。本研究的不足是，對CD80的研究還處于起始階段，CD80增加局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移風險的機制尚不清楚。隨著對鼻咽癌中CD80及其不同受體途徑的深入研究，有助于更深入探究腫瘤免疫微環(huán)境對鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的作用及機制，并為其提供新的治療策略。

作者貢獻：蔡曼波進行課題設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；馮啟勝、陳麗珍、邵建永進行課題實施、評估、資料收集；曾益新進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Influence of CD80and CD86Expression on Progression and Prognosis of Nasopharyngeal Carcinoma

CAIMan-bo,FENGQi-sheng,CHENLi-zhen,SHAOJian-yong,ZENGYi-xin.DepartmentofRadiotherapy,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Correspondingauthor:ZENGYi-xin,SunYat-SenUniversityCancerCenter,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,Guangzhou510060,China;E-mail:zengyixin2016@sina.com

BackgroundCD80and CD86costimulatory molecules have an important role in T cell activation.Low or loss expression of CD80and CD86may lead to the occurrence of tumor immune escape.ObjectiveTo investigate the influence of CD80and CD86expression on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods557 cases,who were diagnosed with nasopharyngeal carcinoma from January 2001 to December 2003 in Sun Yat-Sen University Cancer Center were selected in this study.The cases were pathologically confirmed diagnosis of nasopharyngeal carcinoma with biopsy specimens of corresponding clinical follow-up data.Patients were first diagnosed with NPC without any treatment.During the 2 to 114 months follow-up period,113 patients had distant organ metastasis,235 cases occurred to death.Immunohistochemical method was applied to detect CD80and CD86expression;Kaplan-Meier survival curve,the Log-rank test and single factor Cox proportional hazards regression analysis were adopted to analyze the relationship between the CD80and CD86expression and the progression and the prognosis of NPC patients.ResultsImmunohistochemical method found that CD80and CD86were mainly expressed in tumor cell membrane surface,but little expressed in tumor stroma.Among the 557 patients,309 cases in the low expression group of CD80,248 in the high expression group of CD80;470 cases in the low expression group of CD86,87 in the high expression group of CD86.Kaplan-Meier survival curve and the Log-rank test results showed that there was no significant difference in the disease-free survival time between NPC patients in low expression group and high expression group of CD80(χ2=3.551,P=0.060);and there was significant difference in the overall survival time between NPC patients in low expression group and high expression group of CD80(χ2=5.521,P=0.019).There were no significant difference in disease-free survival time and the overall survival time between NPC patients in low expression group and high expression group of CD86(χ2=0.948，P=0.330;χ2=0.662，P=0.416).The results of single factor Cox proportional hazards regression analysis showed that the risk of metastasis and recurrence and death of NPC patients in high expression group of CD80were higher those that of patients in low expression group of CD80(P<0.05);there were no significant difference in the risk of metastasis and recurrence and death of NPC patients in low expression group and high expression group of CD86(P>0.05).Spearman correlation analysis showed that CD86of NPC tissues was positively correlated with CD68+macrophages numbers in NPC stroma (rs=0.103，P=0.015).ConclusionHigh expression of CD80in NPC tissues is negatively correlated with the prognosis of NPC patients,which increases the risk of local recurrence and distant metastasis.The relationship between expression of CD86and the progression and prognosis of NPC patients is not found.

Nasopharyngeal neoplasms;Antigens,CD80;Antigens,CD86;Prognosis

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) 資助項目(2013CB910301，2011CB504302)；湖南省自然科學基金資助項目(S2016J504B)；湖南省衛(wèi)生廳項目(B2014-051)

421001湖南省衡陽市，南華大學附屬第一醫(yī)院放療科(蔡曼波)；中山大學腫瘤防治中心 華南腫瘤重點實驗室(馮啟勝，陳麗珍，邵建永，曾益新)

曾益新，510060廣東省廣州市，中山大學腫瘤防治中心 華南腫瘤重點實驗室；E-mail：zengyixin2016@sina.com

R 739.6

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.22.015

2016-06-03；

2016-07-07)