不同禽流感病毒含量的新-流二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平的監(jiān)測

江興華　趙華娥　林曉榮　包松英　崔龍萍　王全溪

（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司　福州　350014；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院　福州　350002）

不同禽流感病毒含量的新-流二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平的監(jiān)測

江興華1趙華娥1林曉榮1包松英1崔龍萍1王全溪2*

（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福州350002）

將未濃縮的新城疫抗原分別與未濃縮的、濃縮3倍、濃縮6倍的禽流感抗原混合，并制備成三組雞新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗（簡稱新-流二聯(lián)滅活疫苗），分別免疫21日齡SPF雞，每羽0.3 mL，同時(shí)設(shè)置未免疫的空白對(duì)照組，免疫組與對(duì)照組均在免疫前及免疫后7、14、21、28、35 d進(jìn)行采血，檢測新城疫和禽流感抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各免疫組在免后不同日齡的新城疫抗體基本一致，禽流感病毒抗原濃縮倍數(shù)越高（即禽流感病毒含量越高）的新-流二聯(lián)滅活疫苗，免后14、21 d的抗體也越高；從免后21 d開始，各免疫組的禽流感抗體水平差異逐漸減小，免疫后禽流感抗體水平的高低可以反映該疫苗的免疫效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗可以通過濃縮提高抗原病毒含量的方法來提高免后早期抗體水平，取得良好的早期免疫效果。

新城疫禽流感不同病毒含量二聯(lián)滅活疫苗SPF雞抗體水平監(jiān)測

雞新城疫是由新城疫病毒引起的一種烈性病毒性傳染病，禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一種禽的急性、接觸性、烈性傳染?。?］，兩種疫病均是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的主要疾病。在我國，低致病性禽流感以H9N2亞型為主型，流行范圍廣，占禽流感陽性雞群總數(shù)的93.6%［2］；H9N2亞型禽流感傳播能力強(qiáng)，感染發(fā)病率高，可造成雞群產(chǎn)蛋下降及嚴(yán)重影響肉雞生長速度，與其他病原共同感染導(dǎo)致高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-5］。疫苗免疫是防止新城疫、禽流感暴發(fā)和造成巨大損失的主動(dòng)措施、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和最后防線［6］。因此，研制安全有效的疫苗，對(duì)雞群進(jìn)行免疫接種，使雞群產(chǎn)生免疫力，以保護(hù)雞群免受新城疫、禽流感的侵害是我國畜牧業(yè)發(fā)展的迫切需要，是防控新城疫、禽流感的當(dāng)務(wù)之急［7］。目前市場上的新-流疫苗質(zhì)量不一、免疫效果差別較大。眾所周知，影響疫苗免疫效果的因素很多，抗原病毒含量的高低是其中一項(xiàng)重要影響因素。本研究通過濃縮的方法制備不同流感病毒含量組別的雞新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗，監(jiān)測不同組別疫苗免后的抗體水平，觀察二聯(lián)滅活疫苗的使用效果，從而為制備具有更好免疫效果的新城疫、禽流感二聯(lián)滅活疫苗提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用抗原福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的未濃縮的新城疫抗原、不同濃縮倍數(shù)的流感抗原。

1.1.2試驗(yàn)用疫苗雞新城疫、禽流感 （H9N2 HP株）二聯(lián)滅活疫苗由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司用試驗(yàn)抗原乳化而成，批號(hào)：SY2015003。

1.1.3試驗(yàn)用雞21日齡SPF雞40羽。SPF蛋由濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司提供，福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司自行孵化。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1疫苗的制備使用生產(chǎn)中的新城疫和禽流感抗原，新城疫抗原為收獲的未濃縮的抗原，禽流感抗原為收獲的未濃縮的抗原、進(jìn)行3倍濃縮的抗原、進(jìn)行6倍濃縮的抗原。將新城疫抗原與各組禽流感抗原加入4%吐溫作為水相，按水相與油相比為1：3的比例，使用試驗(yàn)型高速剪切機(jī)，將水相加入油相中進(jìn)行剪切、乳化制成油包水劑型的單苗，然后將新城疫單苗與各組禽流感單苗等量混合均勻作為不同組的雞新城疫、禽流感二聯(lián)滅活疫苗；流感抗原未濃縮的疫苗樣品為A組，流感抗原3倍濃縮的疫苗樣品為B組，流感抗原6倍濃縮的疫苗樣品為C組。

1.2.2試驗(yàn)分組SPF蛋進(jìn)行孵化，出殼的雛雞由本公司自行養(yǎng)至21日齡。選擇健康有活力的雞40羽，隨機(jī)選10羽編為A組，免疫A組疫苗樣品；隨機(jī)選10羽編為B組，免疫B組疫苗樣品；隨機(jī)選10羽編為C組，免疫C組疫苗樣品；余10羽編為D組，為空白對(duì)照組。并對(duì)每羽雞打上翅標(biāo)編號(hào)，試驗(yàn)雞在免前、免后均在隔離器內(nèi)喂養(yǎng)。

1.2.3免疫方法分別將A、B、C組新-流二聯(lián)滅活疫苗樣品免疫21日齡SPF雞，每羽頸部皮下注射0.3 mL；空白對(duì)照組均不免疫。

1.2.4抗體監(jiān)測各免疫組與對(duì)照組均于20日齡（即免前）及免后7、14、21、28、35 d進(jìn)行采血，檢測新城疫與禽流感抗體。

1.2.5抗體檢測方法抗體檢測應(yīng)用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的方法，具體步聚：用PBS將待檢血清做2倍系列稀釋，加入含4HAU血凝素抗原液，并設(shè)PBS 和4HAU血凝素抗原液對(duì)照，充分振搖后，置室溫下至少20 min或在2～8℃下40～60 min，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液，置室溫20～40 min或置2～8℃ 下40～60 min，當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果，以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

2　結(jié)　果

從新城疫、禽流感抗體監(jiān)測結(jié)果可以看出（見表1、圖1-圖2），對(duì)照組新城疫、禽流感抗體在各日齡均為陰性，免疫組新城疫、禽流感抗體均從免后7 d開始迅速上升，免后21 d上升至峰值，然后開始逐漸下降。由于各免疫組疫苗的新城疫抗原含量一樣，所以，免后各時(shí)間的抗體基本一致。而不同組的流感抗原含量不一樣，免后14 d、21 d的抗體有較大的差別，濃縮倍數(shù)越高，兩個(gè)時(shí)間段的抗體值越高；免后28 d及以后，各組流感抗體又非常接近。

表1　新城疫、禽流感抗體水平監(jiān)測結(jié)果

3　結(jié)論與討論

1）目前市場上對(duì)新城疫、禽流感疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)不一，與各廠家疫苗的質(zhì)量有一定的關(guān)系。各廠家疫苗中所含的抗原病毒含量有較大的差異，有的廠家抗原效價(jià)低，有的抗原效價(jià)高，部分廠家的抗原進(jìn)行了不同倍數(shù)的濃縮。本試驗(yàn)免疫不同濃縮倍數(shù)流感抗原制備的疫苗后，抗體水平結(jié)果可以反映不同組疫苗免疫效果的確有一定的差別。在鄭世蘭等［8］的研究中提到，提高單位體積的抗原含量是聯(lián)苗生產(chǎn)的技術(shù)關(guān)鍵，而抗原濃縮是達(dá)到此目的的理想辦法；在張健等［9］的研究也說明這一點(diǎn)，生產(chǎn)雞用聯(lián)苗尤其是生產(chǎn)四聯(lián)苗，單位體積內(nèi)抗原含量是關(guān)鍵，而單純改變疫苗乳化工藝中的油水比例以及通過改變病毒增殖條件均不能達(dá)到多聯(lián)苗生產(chǎn)所需要的抗原含量。因此，尋求一種抗原濃縮的方法使每羽份疫苗中含有足夠的抗原，同時(shí)使免疫劑量盡量減小，是四聯(lián)苗生產(chǎn)中的重要一環(huán)。還有一些關(guān)于不同免疫劑量的免疫效果的研究也同樣說明疫苗中抗原病毒含量的重要性，如溫志芬等［10］研究結(jié)果顯示，0.5 mL/羽劑量的免疫效果比0.1 mL/羽和0.3 mL/羽劑量的免疫效果好，免疫劑量大表明注射到機(jī)體中的抗原含量也相對(duì)多，免疫效果更好。

2）新城疫、禽流感抗體的產(chǎn)生與抗原毒價(jià)（病毒含量）呈正相關(guān)，抗原毒價(jià)越高，抗體產(chǎn)生水平越高，持續(xù)期長［11］。因此，在生產(chǎn)中提升疫苗中的抗原病毒含量是關(guān)鍵，作為疫苗廠家可以通過不同的方法提升抗原的病毒含量，如通過抗原生產(chǎn)工藝改進(jìn)來提升抗原的效價(jià)、通過抗原的濃縮提升抗原的病毒含量等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，禽流感早期抗體的產(chǎn)生與抗原的病毒含量呈正相關(guān)，在免疫后期抗體趨于一致。

3）目前，禽流感感染禽很大一部分在早期，如一個(gè)月內(nèi)的小雞，甚至是10日齡左右的雛雞。而用現(xiàn)有滅活疫苗免疫后，產(chǎn)生抗體較緩慢，不能產(chǎn)生可保護(hù)的抗體水平，所以，在小日齡雞上免疫效果不佳。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過濃縮提升抗原病毒含量，免疫后14～21 d的抗體有相應(yīng)的提升，有更好的免疫效果，但是從生產(chǎn)成本上核算，成本增加了不少，很多廠家難以接受。目前也有很多廠家在尋找更好的方法，如在疫苗中添加免疫增強(qiáng)劑來提升免疫效果，這也是一種很好的方法。趙占民等［12］、陸新浩等［13］在研究中提到，免疫增強(qiáng)劑是一類單獨(dú)使用或與抗原同時(shí)使用、通過非特異性途徑增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的物質(zhì)，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，緩解由環(huán)境造成的免疫功能紊亂，有利于預(yù)防和治療傳染性和條件性疾病。

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Detection of antibodies against bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and unequal contents of avian influenza virus in SPF chickens

Jiang Xinghua1Zhao Huae1Lin Xiaorong1Bao Songying1Cui Longping1Wang Quanxi2*
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，F(xiàn)uzhou 350014；2.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

21-day-old specific pathogen free（SPF）chickens were inoculated with three kinds of bivalent newcastle disease and avian influenza（H9N2 HP strain）inactivated vaccines，which contained original newcastle disease virus（NDV）and primal，three folds of concentration，six folds of concentration of avian influenza virus（AIV），respectively.Every chicken in immune group was inoculated with a dose of 0.3 mL，and simultaneously，chickens were mock inoculated as control group.In order to detection antibodies of NDV and AIV blood samples were collected from both immune group and control group before immunization and at 0，7，14，21，28 and 35 day postimmunization（dpi），respectively.Results showed that，the antibody levels against NDV in each immune groups were basically consistent at different timepoints of post-immunization，the antibody levels against AIV increased depending on the virus quantity at 14 and 21 dpi，and then decreased gradually till to non-difference.Overall，antibody levels against AIV could represent the immune effect of this bivalent inactivated vaccines after immunization，and the improvement of antibody levels and immune effect in early immunization might be obtained by means of increasing the amount of antigens.

Newcastle disease Avian influenza Unequal contents of virus Bivalent inactivated vaccines SPF chickens Antibody levels detection

A

1003-4331（2016）04-0022-03

福州市區(qū)域重大項(xiàng)目（2015-Q-29）資助。

江興華（1975-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士生校外導(dǎo)師。主要從事獸用疫苗的生產(chǎn)與研發(fā)，jxhgreen@163.com。
*

王全溪（1978-），男，副教授，博士研究生，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗拗髋c病原互作，wqx608@126.com。