HPLC測(cè)定委陵菜中委陵菜酸的含量*

鄧仕任，王　鑫，梅曉丹，朱夏敏，夏林波

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

HPLC測(cè)定委陵菜中委陵菜酸的含量*

鄧仕任，王鑫，梅曉丹，朱夏敏，夏林波*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

目的：建立高效液相色譜測(cè)定委陵菜藥材中委陵菜酸含量的方法，為委陵菜的合理質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Agilent XDB-C18色譜柱（4.6×150mm，5μm），流動(dòng)相乙腈—水（60∶40，V∶V），檢測(cè)波長(zhǎng)206nm。結(jié)果：委陵菜酸在0.104～1.04mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9997（n=6），加樣回收率101.3%，RSD=1.87%（n=6）；3批委陵菜藥材中委陵菜酸的含量為0.25～0.46mg·g-1。結(jié)論：委陵菜酸為委陵菜藥材中的特征活性成分，所建立的含測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，可作為委陵菜藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

委陵菜；委陵菜酸；HPLC；含量測(cè)定

委陵菜為薔薇科植物委陵菜Potentilla chinensis Ser.的干燥全草，其味苦、性寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒，涼血止痢的功效，常用于赤痢腹痛，癰腫瘡毒等癥［1］，是一味常用中草藥?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，委陵菜尚具有一定的降糖功能，已在部分地區(qū)用于二型糖尿病的臨床治療［2］。我們的前期研究表明，委陵菜的醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的體外抑制活性，這可能是其治療糖尿病的作用機(jī)制之一。委陵菜的主要成分有黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等［3，4］。目前，對(duì)委陵菜的質(zhì)量控制研究主要集中在黃酮類化合物中［5］，而基于其三萜類成分展開(kāi)的研究幾乎為空白。委陵菜酸為委陵菜中的特征三萜類成分，藥理研究表明，其具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、降糖、保肝、抗腫瘤等多方面生理活性［6-8］，為委陵菜的主要藥效成分。本實(shí)驗(yàn)擬以委陵菜酸為指標(biāo)成分，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，建立委陵菜藥材中委陵菜酸的HPLC分析方法，以期為委陵菜藥材的合理質(zhì)量控制提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥

安捷倫1100高效液相色譜儀；FA1004B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DFT-100型手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ2200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

委陵菜酸對(duì)照品（純度大于98.5%美國(guó)BOC Sciences公司）；甲醇（AR）；乙腈（CP天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水（娃哈哈純凈水）。

3批委陵菜藥材均采集于遼寧省鞍山市千山地區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)植物教研室王冰教授鑒定為薔薇科植物委陵菜Potentilla chinensis Ser.的干燥全草。

1.2方法

1.2.1色譜條件

安捷倫XDB-C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-水（60∶40，V∶V）；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)206nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL。

1.2.2對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察

取委陵菜酸對(duì)照品適量，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，得濃度為1.04mg· mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。將該儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋，配成濃度分別為 0.104、0.208、0.416、0.624、0.832、1.04mg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。將上述對(duì)照品溶液依次注入液相色譜儀，進(jìn)樣量為20μL。以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，得回歸方程為y=1.61×106x+6632，委陵菜酸在0.10～1.04mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9997，n=6）。

1.2.3供試品溶液的制備

取委陵菜粉末（過(guò)40目篩）約2.0g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入100mL甲醇浸泡過(guò)夜，超聲提取三次，每次20min，過(guò)濾合并提取液，減壓濃縮至干后，以甲醇溶解后轉(zhuǎn)入1mL容量瓶中，定容至刻度，測(cè)定前置于4℃保存?zhèn)溆?，進(jìn)樣分析前經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1精密度

精密稱取同一委陵菜藥材按1.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得保留時(shí)間RSD=0.91%，峰面積RSD=0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一委陵菜藥材按1.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h測(cè)定峰面積。平均峰面積為811660，RSD=1.84%（n=6）。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一委陵菜藥材6份，按1.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，測(cè)得樣品中委陵菜酸含量的平均值為0.25mg·g-1，RSD=1.01%，證明本方法重復(fù)性良好。

2.4加樣回收率試驗(yàn)

取已知委陵菜酸含量（0.25mg·g-1）的藥材9份，每份約2g，精密稱量，3份為一組，置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度委陵菜酸對(duì)照品貯備液，按1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果平均加樣回收率101.3%，RSD=1.87%（n=9）。

2.5樣品含量的測(cè)定

分別取3批委陵菜藥材約各2g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，其色譜峰見(jiàn)圖1。

圖1　委陵菜藥材HPLC圖Fig.1　HPLC chromatography of Potentilla chinensis Ser

記錄下峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中含有委陵菜酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　委陵菜藥材中委陵菜酸含量測(cè)定結(jié)果Tab.1　Content of tormentic acid in Potentilla chinensis Ser

3　結(jié)論

（1）委陵菜為多年生草本，全國(guó)大部分地區(qū)有分布，主產(chǎn)于山東、遼寧、安徽等地。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，委陵菜具有清熱解毒，涼血止痢等作用，主要用于治痢疾，風(fēng)濕筋骨疼痛，癱瘓，癲癇，瘡疥等癥。在對(duì)遼寧千山地區(qū)的道地遼藥進(jìn)行降糖活性的篩選過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)委陵菜具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶體外抑制活性，該結(jié)果提示其可能對(duì)二型糖尿病具有一定的治療作用。相關(guān)文獻(xiàn)［2］也表明，在京津地區(qū)，委陵菜已在臨床上被用作二型糖尿病的治療藥物。

（2）委陵菜酸為19α-羥基烏蘇烷型三萜化合物，是委陵菜藥材中的特征成分。有文獻(xiàn)［6］表明，從西班牙Poterium ancistroides Deaf植物的地上部分所分離出來(lái)的委陵菜酸能夠降低正常大鼠與葡萄糖誘發(fā)的高血糖大鼠的血糖濃度，同時(shí)升高胰島素濃度，為降糖活性成分。還有研究［7］表明，從委陵菜中所純化的委陵菜酸能夠減輕脂多糖引起的小鼠急性肝損傷，具有保肝作用。此外，委陵菜酸的抗菌、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用也時(shí)有報(bào)道［8］。由此可見(jiàn)，委陵菜酸為委陵菜的特征藥效成分，以此作為委陵菜質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分是比較合理的。

（3）本文首次采取HPLC法，對(duì)3批產(chǎn)自遼寧千山地區(qū)的委陵菜藥材中的委陵菜酸進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果分布在0.25～0.46mg·g-1范圍內(nèi)。我們所建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、靈敏度高，可為委陵菜藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.214.

［2］ 陸璐，李素君，劉宗林，等.委陵菜降血糖成分的機(jī)理研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（6）：387-391.

［3］ 高雯.委陵菜的化學(xué)成分研究［D］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2007.

［4］ 劉普，段宏泉，潘勤，等.委陵菜三萜成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，22：1875-1879.

［5］ 孫曉陽(yáng)，劉玉凱，繆月英，等.委陵菜中黃酮類成分HPLC指紋圖譜的研究［J］.廣東化工，2015，42（18）：13-14.

［6］ 周和平.委陵菜酸對(duì)離體大鼠胰島的胰島素分泌的影響［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，1990，（2），43-44.

［7］ Lin X，Zhang S，Huang R，et al.Protective effect of tormentic acid from Potentillachinensisagain stlipopoly saccharide/D-galactosamine induced fulminant hepatic failure in mice［J］.International immunopharmacology，2014，19（2）：365-372.

［8］ 張晶，劉洋，李靈芝.委陵菜酸藥理活性研究現(xiàn)狀［J］.武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，（1）：67-69.

Determination of tormentic acid in Potentilla chinensis Ser by HPLC*

DENG Shi-ren，WANG Xin，MEI Xiao-dan，ZHU Xia-min，XIA Lin-bo*
（College of Pharmacy，Liaoning Uniuersity of Traditional Medicine，Dalian 116600，China）

Objective：An HPLC method for determination of tormentic acid in Potentilla chinensis Ser.was developed to provide a quality control method for Potentilla chinensis Ser.Methods：The chromatography was carried out on an Agilent XDB-C18column（4.6×150mm，5μm）with acetonitrile-water（60∶40，V∶V）as the mobile phase，the detection wavelength was set at 206 nm.Results：Tormentic acid could be successfully determined and the linear rang was 0.104～1.04μg·mL-1（r=0.9997）.The average recoveries（n=6）of the tormentic acid was 101.3%，RSD=1.87%.The content of tormentic acid in 3 batches was 0.25～0.46mg·g-1.Conclusion：Tormentic acid was the specific ingredient in Potentilla chinensis Ser.The method is accurate，reliable and sensitive for quality control of Potentilla chinensis Ser.

Potentilla chinensis Ser；tormentic acid；HPLC；determination

R284.1

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160725

2016-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202857）；遼寧省自然科學(xué)基金（2015020713）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（LJ Q2015070）

鄧仕任（1979-），男，博士，副教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

夏林波（1977-），女，博士，副教授。