廣東省免費孕前優(yōu)生健康檢查地中海貧血基因檢測結果分析

李銘臻 趙文忠 朱志勇 顧 恒 周冰燚 鄭立新

廣東省計劃生育專科醫(yī)院(廣州，510600)

廣東省免費孕前優(yōu)生健康檢查地中海貧血基因檢測結果分析

李銘臻 趙文忠 朱志勇 顧 恒 周冰燚 鄭立新*

廣東省計劃生育專科醫(yī)院(廣州，510600)

目的：分析近兩年廣東省免費孕前優(yōu)生健康檢查地中海貧血基因檢測結果，為地中海貧血防控工作提供依據(jù)。方法：以廣東省各縣區(qū)參加免費孕前優(yōu)生健康檢查的新婚夫婦為研究對象，MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作為地中海貧血篩查陽性指標，夫婦雙方篩查均為陽性時，需同時進行α及β地中海貧血基因檢測。結果：16240例篩查陽性者中發(fā)現(xiàn)基因攜帶者12995例(80.0%)準確率為80.0%，部分縣區(qū)>90%。發(fā)現(xiàn)3382對夫婦有妊娠重型地中海貧血胎兒的可能，產(chǎn)前診斷的需求率為41.65%。結論：MCV聯(lián)合MCH作為篩查地中海貧血陽性指標可靠，操作簡單，便于在基層應用，但需加強實驗室質(zhì)量控制。

地中海貧血；篩查；準確性；防控

地中海貧血(簡稱地貧)是由于α和(或)β珠蛋白基因發(fā)生突變或缺失，使得血紅蛋白中一種或幾種珠蛋白肽鏈不能合成或合成速率降低，導致血紅蛋白中珠蛋白鏈生成失去平衡，而造成的溶血性貧血[1]。地貧有明顯的地域、人群差異，多見于地中海、非洲、東南亞等地區(qū)，廣東省是我國地貧高發(fā)的省份之一[2]。本病重型患者目前尚無法根治，通過血液學的篩查、地貧基因診斷，對同型地貧的高風險夫婦進行產(chǎn)前診斷，淘汰重型胎兒，是目前預防本病最有效的方法[3]。2012年起，廣東省在全省范圍內(nèi)進行地貧防控工作，已初步取得顯著成效。本研究對相關資料進行分析，為防控提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年11月～2014年12月，參加廣東省各縣區(qū)、街道(鎮(zhèn))婚育學校學習的育齡夫婦。對育齡夫婦進行免費孕前優(yōu)生健康檢查，發(fā)現(xiàn)夫婦地貧篩查結果均為陽性后，進行地中海貧血基因檢測。以篩查陽性16240人(8120對夫婦)作為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 地貧篩查 由廣東省各縣區(qū)計劃生育服務站、當?shù)蒯t(yī)院進行。各檢測機構按技術規(guī)范的要求，用全自動血細胞分析儀對血液樣本進行測定。實驗室每天進行室內(nèi)質(zhì)量控制，每年全省進行2～4次的室間質(zhì)量控制。以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作為地貧篩查陽性指標。當夫婦雙方地貧篩查均為陽性時，將該夫婦血樣通過快遞形式郵寄到廣東省計劃生育?？漆t(yī)院進行地貧基因檢測。

1.2.2 血樣郵寄 由潮州凱普生物化學有限公司提供地中海貧血篩查血樣本采集卡(簡稱采集卡)。各篩查機構將地貧篩查陽性的血樣滴進采集卡，自然風干，分別裝進專用密封袋后快遞到廣東省計劃生育?？漆t(yī)院優(yōu)生技術中心。收到快遞后，中心先檢查裝有采集卡的密封袋是否完好，血斑是否合符要求、有無發(fā)霉等異常情況。對不符合檢測要求的血樣，要求當?shù)刂匦录乃蜆吮?；合格的血樣同時進行α及β地貧基因檢測。

1.2.3 地貧基因檢測 DNA提取、α和β地貧基因擴增、反向斑點雜交以及雜交膜條顯色均使用潮州凱普生物化學有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒及α-和β-地中海貧血基因檢測試劑盒，(國食藥監(jiān)械(準)字2012第3400399號)，嚴格按說明書上的步驟、條件進行實驗。主要步驟為：①DNA提取，將采集卡上的血斑剪下，用血液基因組DNA提取試劑盒進行DNA提?。虎讦恋刎毣驍U增，DNA樣本6ul，反應總體系45ul按以下程序進行擴增：95℃，15min后進入35個循環(huán)：98℃，40sec；64℃，70sec；72℃，150sec；72℃，5min；4℃保存；③β地貧基因擴增，DNA樣本3ul，反應總體系50ul按以下程序進行擴增：37℃，5min ；94℃，3min后進入40個循環(huán)：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，5min；4℃保存；④雜交、顯色，用試劑盒內(nèi)配套的試劑進行實驗。在導流雜交儀中放置好地貧基因反向斑點雜交膜條后，加入經(jīng)過變性的α地貧和β地貧PCR產(chǎn)物，進行雜交、顯色。全過程均在導流雜交儀中進行，顯色后的雜交膜條晾干后可長期保存。

1.3 地貧基因檢測結果判讀

地貧基因反向斑點雜交膜條設3個α和6個β正常對照點，可同時檢測3種α地貧缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3種突變型基因(CS、QS、WS)及15種常見β地貧突變型基因。每次實驗所有正常對照點均應顯色，突變純合子及缺失純合子除外，否則需重新進行全部實驗，從提取DNA進行PCR到雜交、顯色。圖1為雜交膜條上各雜交位點對應圖，出現(xiàn)地貧基因突變、缺失時在相應位置會出現(xiàn)雜交信號。圖2-5為不同類型地貧基因攜帶者的雜交膜條掃描圖，依次分別為α地貧3.7缺失雜合子、β地貧41-42突變雜合子、α地貧3.7缺失純合子以及α地貧WS突變復合β地貧41-42突變雜合子。

1.4 統(tǒng)計學分析

資料采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。描述性統(tǒng)計用地貧篩查的準確率(基因檢測陽性/初篩陽性)和可能妊娠重型地貧兒的百分比。方差分析比較地貧基因攜帶者與非地貧基因攜帶者MCV、MCH水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 地貧篩查及基因檢測結果

16240例地貧篩查陽性者中，發(fā)現(xiàn)12995例地貧基因攜帶者，占80.0%。α地貧基因攜帶9224例，占基因陽性者的80.0%，β地貧基因攜帶4419例，占34.0%，其中 648例α復合β地貧基因攜帶，占5.0%。地貧基因攜帶者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg的12564例，占96.7%；MCV≤82 fl，MCH>27pg的85例，占0.7%；MCV>82 fl，MCH≤27pg的346例，占2.7%。

2.2 各縣區(qū)檢測準確率

全省121個縣區(qū)中持續(xù)送檢的80個，其中送檢標本量超過300例的縣區(qū)共有15個，分別計算其地貧篩查準確率(地貧基因攜帶例數(shù)/送檢總數(shù))，按準確率從高到低排序，結果如表1所示。16240例送檢對象的MCV、MCH分別為70.45±6.61 fl，22.76±3.01 pg。比較地貧組和非地貧組MCV和MCH水平，地貧組的MCV和MCH均比非地貧組低(P<0.001)。

表1 送檢標本量>300例的縣區(qū)準確率統(tǒng)計表

表2 16240名調(diào)查對象MCV和MCH水平

2.3 重型地貧兒妊娠概率

8120對夫婦中有3382對夫婦可能妊娠重型地貧兒(41.65%)，其中可能妊娠巴氏水腫胎2705對，占79.98%；可能妊娠重型β地貧660對，占19.52%；可能妊娠巴氏水腫胎或重型β地貧17對，占0.50%。產(chǎn)前診斷需求為41.65%。

3 討論

3.1 MCV聯(lián)合MCH篩查地貧便于基層，實驗室質(zhì)量控制需加強

廣東省是我國地貧的高發(fā)省份之一，以往資料顯示廣東省α地貧基因攜帶率為8.30%～8.85%[4-5]，β地貧基因攜帶率為3.36%～3.73%[2，6]。地貧的篩查方法多樣，有紅細胞脆性一管法、血紅蛋白電泳等，經(jīng)過多年的驗證，MCV、MCH聯(lián)合篩查能提高地貧檢測的靈敏度[3，7]。近兩年在全省地貧防控工作中，以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg聯(lián)合作為地貧篩查陽性的指標，以降低漏診率。本次全省地貧篩查陽性篩查率為80.0%，部分縣區(qū)>90%，可見以MCV及MCH作為地中海貧血篩查的陽性指標是簡單而且可靠的，便于在基層推廣應用。在12995例地貧基因攜帶者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg 12564例，MCV≤82 fl，MCH>27pg的346例；MCV>82 fl，MCH≤27pg的85例，即只有一項篩查指標陽性的431例，占3.32%(431/12995)。所以MCV、MCH聯(lián)合篩查有助于提高地貧篩查的靈敏度，降低漏診率。

在送檢標本量>300例的15個縣區(qū)中，篩查準確率最高的達94.23%，而最低的只有53.86%，存在明顯的差距。因此，實驗室質(zhì)量控制必須定期進行。開展實驗室室間質(zhì)量控制，可促進各實驗室檢測質(zhì)量和水平的提升[8]。加強實驗室室間質(zhì)量控制后，MCV聯(lián)合MCH作為地中海貧血篩查陽性指標的準確率有望得到進一步提高，對減少地貧基因檢測費用的投入，地貧的研究均有重大意義。

3.2 地貧防控工作任務艱巨，必須加大防控力度

根據(jù)孟德爾遺傳定律，夫婦雙方α地貧基因中同時攜帶--SEA時，有1/4的機會妊娠巴氏水腫胎；同為β地貧突變基因攜帶時妊娠重型β地貧兒的概率為1/4；而雙方均為--SEA攜帶復合β地貧時妊娠重型地貧兒的概率為7/16?？赡苋焉锇褪纤[胎的有2705對夫婦；可能妊娠重型β地貧兒的有660對；兩者均有可能的有17對。上述合計3382對夫婦有必要進行產(chǎn)前診斷，避免重型地貧兒的出生，尤其是重型β地貧兒。夫婦雙方地貧篩查均為陽性后，產(chǎn)前診斷的需求率為41.65%。其中可能妊娠巴氏水腫胎的占大多數(shù)(80%)，這與廣東人群α地貧基因攜帶率高于β地貧基因攜帶有關[2-6]。

市級醫(yī)院陸續(xù)開展地貧基因檢測項目，其下屬縣區(qū)的地貧基因檢測可于當?shù)剡M行。全省121個縣區(qū)近兩年有持續(xù)送標本至本中心檢測的有80個，所以全省妊娠重型地貧兒的可能數(shù)目將超過上述數(shù)字。若地貧基因攜帶的夫婦從優(yōu)生角度考慮，血紅蛋白H病等中間型地貧胎兒也進行淘汰，產(chǎn)前診斷的需求率將更高。2010年第六次全國人口普查的數(shù)據(jù)顯示，廣東省已成為全國人口數(shù)量第一大省，人群數(shù)量龐大，地貧攜帶率高。廣東省進行地貧防控已有多年，已取得初步成效及經(jīng)驗，但防控工作任務依然艱巨，需繼續(xù)加大防控力度。

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[責任編輯：董 琳]

Analysis of results of thalassemia genes testing in project of free pre-pregnancy aristogenesis detecting of Guangdong province

LI Mingzhen, ZHAO Wenzhong, ZHU Zhiyong, GU Heng, ZHOU Bingyi, ZHENG Lixin*

FamilyPlanningSpecialHospitalofGuangdong,Guangdong, 510600

*Correspondingauthor：ZhengLixin，Email:605512183@qq.com

Objective: To analyze thalassemia gene detecting results in nearly two years of free pre-pregnancy eugenics health examination of Guangdong province, and to provide evidences for preventing and controlling halassemiathe. Method: Newly married couples who attended the free pre-pregnancy health care of Guangdong were recruited. MCV≤82 fl or (and) MCH≤27 pg was positive indicators for thalassemia screening . When the screening results of both husband and wife were positive, α and β thalassemia gene was detected subsequently. Result: In the 16240 cases whose thalassemia screening results were positive, 12995 cases were diagnosed as thalassemia gene carriers. According to the statistics, the accuracy rate of thalassemia screening was 80.02% in Guangdong province, and accuracy rate were even more than 90% in some counties. At the same time, 3382 couples had fetus with risk of severe thalassemia, so 41.65% couples needed to recieve prenatal diagnosis. Conclusion: MCV combining with MCH as the positive indicator for thalassemia screening is reliable. And it is easy to be used in the grass-root service setting because of simpleness for operation. However, laboratory quality control should be strengthened. The prevention and controlling thalassemia should be strengthened as it is a hard work.

Thalassemia; Screen; Accuracy; Prevention and controlling

廣東省人口計生委基金項目(20132035)

2015-03-10

2016-05-19

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.07

*通訊作者：605512183@qq.com