福建地區(qū)269對(duì)同型地中海貧血基因攜帶者夫婦產(chǎn)前基因診斷結(jié)果分析

林 娜 黃海龍 王 燕 王林鑠 李 英 郭丹華 何德欽 徐兩蒲 林 元

福建省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建省產(chǎn)前診斷與出生缺陷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福州，350001)

·臨床研究·

福建地區(qū)269對(duì)同型地中海貧血基因攜帶者夫婦產(chǎn)前基因診斷結(jié)果分析

林 娜 黃海龍 王 燕 王林鑠 李 英 郭丹華 何德欽 徐兩蒲 林 元*

福建省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建省產(chǎn)前診斷與出生缺陷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福州，350001)

目的：了解同型地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)基因攜帶者夫婦胎兒基因診斷情況，為遺傳咨詢提供依據(jù)。方法: 2008年5月～2014年12月在本院確診均為同型地貧基因攜帶者夫婦269對(duì)(同為α地貧基因攜帶者177對(duì)，同為β地貧基因攜帶者87對(duì)，其中一方為復(fù)合α、β地貧攜帶者5對(duì))，通過(guò)胎兒絨毛、羊水、臍血獲取胎兒標(biāo)本提取DNA，應(yīng)用Gap-PCR和PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)等方法進(jìn)行α、β地貧基因診斷，胎兒標(biāo)本同時(shí)行染色體核型分析。產(chǎn)前診斷后1年隨訪妊娠結(jié)局。結(jié)果: 177對(duì)α地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前基因診斷結(jié)果為46例(26.0%)正常；68例(38.4%)雜合子；63例(35.7%)嚴(yán)重型地貧基因，其中55例巴氏水腫胎(51例東南亞缺失型純合子，4例少見泰國(guó)缺失型α地貧1和東南亞型雙重雜合子)，8例HbH病。87對(duì)β地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前基因診斷結(jié)果為23例(26.4%)正常；39例(44.8%)雜合子；25例(28.7%)嚴(yán)重型地貧基因，其中9例純合子及16例雙重雜合子。5對(duì)一方為復(fù)合α、β地貧攜帶者夫婦中產(chǎn)前基因診斷結(jié)果正常1例，地貧雜合子2例，α、β復(fù)合地貧1例，β地貧雙重雜合子1例。266例胎兒細(xì)胞染色體核型分析正常，3例胎兒核型異常，分別為21三體1例、13三體1例、45，X1例。63例嚴(yán)重類型α地貧胎兒、26例嚴(yán)重類型β地貧胎兒、3例染色體異常胎兒均在孕期引產(chǎn)。結(jié)論: 同型地貧基因攜帶者夫婦胎兒基因診斷可檢出Hb Bart’s胎兒水腫綜合征、Hb H病等重中型α地貧胎兒，以及β地貧純合子、雙重雜合子重型β地貧胎兒，應(yīng)重視罕見突變基因型的檢測(cè)，檢測(cè)地貧基因同時(shí)應(yīng)行染色體檢查以排除染色體病。

地中海貧血；基因型；產(chǎn)前診斷；核型分析

α和β型地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是人群中最常見的地貧類型，我國(guó)南方省份如廣西、廣東、福建為地貧高發(fā)區(qū)[1]。由于目前缺乏對(duì)重型地貧的有效治療方法，因此，夫婦雙方為同型地貧基因攜帶者在妊娠早期或中期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，阻止重型地貧兒出生，是最積極有效的預(yù)防措施。筆者對(duì)夫婦雙方為同型地貧攜帶者孕婦進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，并隨訪妊娠結(jié)局，為遺傳咨詢提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

2008年5月～2014年12月，在本院產(chǎn)前診斷中心確診為同型地貧攜帶者的夫婦269對(duì)，在簽署知情同意書后行產(chǎn)前基因診斷和染色體核型分析。269對(duì)夫婦中均為α地貧基因攜帶者177對(duì)，均為β地貧基因攜帶者87對(duì)，其中一方為復(fù)合α、β地貧基因攜帶者5對(duì)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和胎兒DNA的提取 根據(jù)孕周選擇標(biāo)本采集方式，共獲得16例絨毛、195例羊水、58例臍帶血標(biāo)本。標(biāo)本部分用于DNA的提取，其余部分用于細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。DNA提取方法按地貧基因診斷試劑盒(深圳益生堂生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 α珠蛋白基因檢測(cè) 采用Gap-PCR方法診斷中國(guó)人常見的東南亞型(--SEA)基因缺失、-α3.7基因缺失和-α4.2基因缺失等3種缺失型α-地貧基因，采用反向斑點(diǎn)雜交法( PCR-RDB)檢測(cè)常見的α-珠蛋白基因αCS、αQS和αWS3種點(diǎn)突變型地貧基因，檢測(cè)方法按試劑盒(深圳益生堂生物技術(shù)有限公司)操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 β珠蛋白基因檢測(cè) 采用PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交法(PCR-RDB)，檢測(cè)中國(guó)人常見的β地貧基因17 種基因突變類型，檢測(cè)方法按試劑盒(深圳益生堂生物技術(shù)有限公司)操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 泰國(guó)缺失型α地貧和Hkαα基因檢測(cè) --THAI/αα缺失型基因采用Gap-PCR技術(shù)分析，Hkαα采用單重PCR和巢式PCR進(jìn)行，參照文獻(xiàn)[2-3]方法進(jìn)行。

1.2.5 胎兒細(xì)胞遺傳檢查 絨毛、羊水及臍血的培養(yǎng)、制片、G顯帶，通過(guò)GSL-120全自動(dòng)染色體掃描平臺(tái)進(jìn)行核型采集和分析。每例計(jì)數(shù)20個(gè)核型，分析5個(gè)，如遇異常則增加計(jì)數(shù)和分析。

1.3 隨訪

269例孕婦均在產(chǎn)前診斷后1年電話隨訪，了解嚴(yán)重類型地貧胎兒結(jié)局、非嚴(yán)重類型地貧胎兒出生后表型和發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 同型地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前基因診斷

269對(duì)同型地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前診斷共檢出63例(23.4%)嚴(yán)重類型α地貧胎兒(包括巴氏水腫胎和HbH病)、26例(9.7%)嚴(yán)重類型β地貧胎兒(包括突變純合子及雙重雜合子)，共89例(占33.1%)。見表1。

表1 269對(duì)同型地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前診斷分析

2.2 夫婦同為α地貧基因攜帶者產(chǎn)前基因診斷

夫婦同為α地貧基因攜帶者177例孕婦中產(chǎn)前診斷檢出3種常見α地貧缺失型基因(--SEA基因缺失、-α3.7基因缺失和-α4.2基因缺失)、3種非缺失型基因(αCS、αQS和αWS)、少見的泰國(guó)缺失型α-地貧1基因(--THAI)及香港型(HKαα)共8種突變基因類型。見表2。

表2 177對(duì)同型α地貧基因攜帶者 夫婦產(chǎn)前基因診斷分析

2.3 夫婦同為β地貧基因攜帶者產(chǎn)前基因診斷結(jié)果

87對(duì)同為β地貧基因攜帶者夫婦中產(chǎn)前基因診斷正常23例、雜合子39例、純合子9例及雙重雜合子16例。共檢出6種常見β地貧基因類型，見表3。

2.4 同型地貧基因攜帶者夫婦中一方為復(fù)合α、β地貧基因攜帶者產(chǎn)前基因診斷

同型地貧基因夫婦中一方為復(fù)合α、β地貧基因攜帶者5對(duì)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，其中產(chǎn)前基因診斷正?；蛐?例[母親基因類型為-28(A→G)/N，父親基因型為-28(A→G)/N合并--SEA/αα]；地貧雜合子2例，其中1例胎兒基因型為-α3.7/αα[母親基因型為CD41-42(-TCTT)/N，父親基因型為-28(A→G)/N合并-α3.7/αα]，另1例胎兒基因型為--SEA/αα[母親基因型為IVS-2-654(C→T)/N合并--SEA/αα，父親基因型為CD17(A→T)/N ]；1例復(fù)合α、β地貧[母親基因型為CD27-28(+C)/N合并--SEA/αα，父親基因型為-28(A→G)/N)]；1例β-地貧雙重雜合子CD41-42/ CD17(A→T)[母親基因型為CD41-42(-TCTT)/N合并--SEA/αα，父親基因型為CD17(A→T)/N]。

表3 87對(duì)同為β地貧基因攜帶者 夫婦產(chǎn)前基因診斷分析

*N代表無(wú)突變

2.5 胎兒細(xì)胞遺傳檢查

269例產(chǎn)前診斷標(biāo)本行細(xì)胞染色體核型分析，266例正常，3例羊水基因診斷結(jié)果雖然為α地貧雜合子，但染色體核型分析為21三體1例、13三體1例、45，X 1例。

2.6 隨訪

269例行產(chǎn)前診斷的孕婦未發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥，92例胎兒引產(chǎn)，包括51例東南亞型純合子及4例泰國(guó)缺失型α地貧和東南亞型雙重雜合子(--THAI/--SEA)；8例Hb H??；9例β地貧突變純合子及17例β地貧雙重雜合子；3例染色體核型異常。引產(chǎn)胎兒取臍帶血行地貧基因診斷，與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。其余則選擇繼續(xù)妊娠，產(chǎn)前診斷1年后電話隨訪證實(shí)，胎兒出生后半年無(wú)重度貧血表型，發(fā)育情況正常。

3 討論

福建地處東南沿海，是地貧高發(fā)區(qū)，2013年報(bào)道福建人群α和β地貧的發(fā)生率分別為3.17%和1.32%，總發(fā)生率達(dá)4.4%[4]。增加地貧產(chǎn)前篩查率，提高產(chǎn)前診斷檢出率，降低漏診率，減少誤診率，是目前防治地貧的主要目標(biāo)。

本資料中同型地貧基因攜帶者夫婦269對(duì)中，產(chǎn)前基因診斷檢出63例(23.4%)嚴(yán)重類型α地貧胎兒(包括巴氏水腫胎和HbH病)、26例(9.7%)嚴(yán)重類型β地貧胎兒(包括突變純合子及雙重雜合子)。提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中間型、重型地貧的檢出較高。因此重視篩查高危人群，并追蹤和產(chǎn)前診斷可有效降低地貧患兒出生率。本資料中α地貧產(chǎn)前診斷以東南亞型為主，β地貧以IVS-2-654和CD41-42為主，這一結(jié)果與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果基本吻合[4]。

目前醫(yī)院的地貧篩查模式通常以孕婦篩查為主(包括血常規(guī)和血紅蛋白分析)，孕婦篩查異常時(shí)才對(duì)丈夫行地貧基因檢測(cè)，這樣容易漏診。因?yàn)榉驄D雙方中女方為α-1地貧時(shí)，有典型的平均紅細(xì)胞(MCV)體積下降，不會(huì)漏診；而女方為α-2地貧基因攜帶者、男方為α地貧1基因攜帶者時(shí)，則由于α-2地貧基因攜帶者(輕型、靜止型尤其是HbCS患者) MCV可以正常，血紅蛋白分析缺乏特異性改變，容易漏診。在本資料中就有55對(duì)夫婦一方是東南亞型，一方是α-2地貧基因攜帶者，其中9例胎兒基因診斷為Hb H病。故當(dāng)一方已經(jīng)確診為地貧基因攜帶者，另外一方必須進(jìn)行分子生物學(xué)檢查。本資料中177對(duì)同型α地貧基因攜帶者夫婦產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)55例巴氏水腫胎兒，其中51例為東南亞純合子，另外4例泰國(guó)缺失型α地貧1和東南亞缺失型雙重雜合子胎兒，超聲檢查也表現(xiàn)為水腫綜合征。泰國(guó)缺失型α地貧1僅在我國(guó)廣東、廣西、臺(tái)灣、福建等地區(qū)有報(bào)道[5-8]，而且這種罕見的地貧類型基因檢測(cè)不是常規(guī)的篩檢項(xiàng)目。本資料中有4對(duì)就屬于這種情況，一方為東南亞型，但另一方未檢出常見缺失類型，若沒有進(jìn)一步行罕見泰國(guó)缺失型α地貧1基因型的診斷，很容易漏診。臨床上針對(duì)那些有不明原因水腫胎兒生育史的夫婦，應(yīng)考慮可能是少見的泰國(guó)缺失型α地貧引起的非免疫性胎兒水腫。本資料中1例罕見基因型HKαα/--SEA，其地貧臨床癥狀要明顯輕于缺失型Hb H病-α3.7/ --SEA。而HKαα/--SEA與--SEA/αα基因型胎兒，出生時(shí)HbBart's水平都在一定的范圍，無(wú)明顯的血液學(xué)和臨床區(qū)別。此胎兒父親基因常規(guī)檢測(cè)為-α3.7/αα，母親為--SEA/αα，胎兒α2、-α3.7、--SEA3種條帶同時(shí)出現(xiàn),最終發(fā)現(xiàn)父親實(shí)際為HKαα/αα。目前商品化的α地貧檢測(cè)試劑盒只針對(duì)中國(guó)人常見的3種缺失和3種突變類型，不能檢測(cè)出泰國(guó)缺失型α地貧1及HKαα等，極易發(fā)生漏診，臨床醫(yī)生應(yīng)加強(qiáng)認(rèn)識(shí)，對(duì)可疑者，應(yīng)補(bǔ)充罕見型地貧基因檢測(cè)，避免漏診。

絕大多數(shù)β地貧患者表現(xiàn)為典型的小細(xì)胞低色素貧血、HbA2增高，不易漏診；β地貧的表征會(huì)掩蓋α地貧的表征，對(duì)于雙重地貧攜帶者，胎兒需做α和β兩種地貧的基因診斷，以避免漏診。

目前產(chǎn)前診斷方法取材主要來(lái)自絨毛、羊水和臍血，在對(duì)269對(duì)同型地貧基因攜帶者夫婦進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因診斷的同時(shí)進(jìn)行胎兒染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)有3例羊水培養(yǎng)染色體核型異常而終止妊娠。因此在地貧產(chǎn)前診斷的同時(shí)，也應(yīng)行染色體檢查，排除常見染色體病，避免引起醫(yī)療糾紛。

中國(guó)南方部分地區(qū)由于較高的地貧基因攜帶率應(yīng)該開展前瞻性的地貧篩查和產(chǎn)前診斷工作，即夫婦孕前同時(shí)進(jìn)行地貧篩查；應(yīng)重視復(fù)合型地貧的基因診斷；注意檢測(cè)有無(wú)罕見類型地貧；地貧產(chǎn)前基因檢測(cè)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)有無(wú)染色體病。通過(guò)對(duì)高危者進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，可以防止重型地貧兒的出生及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，從而提高出生人口素質(zhì)。

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[責(zé)任編輯：張 璐]

Analysis of prenatal gene diagnosis results of the 269 couples with the same type of thalassemia in Fujian provine

LIN Na, HUANG Hailong, WANG Yan, WANG Linshuo, LI Ying, GUO Danhua, HE Deqing, XU Liangpu, LIN Yuan*

CenterofPrenatalDiagnosis,FujianMaternityandChildrenHealthHospital，TeachingHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou，F(xiàn)ujian350001

Objective: To understand results of the prenatal gene diagnosis of the couples with the same thalassemia type. Method: From May 2008 to December 2014, 269 couples with the same thalassemia type from Fujian Maternity and Children Health Hospital were recruited, which including 177 α thalassemia couples ,87 βthalassemia couples, and among them , wife or husband of 5 couples wereαandβthalassemia. Genomic DNA was extracted from villus, amniotic fluid or cord blood from the fetuses. Gap polymerase chain reaction (gap PCR) and reverse dot blot (RDB) technology were used to detect the common α and β thalassemia mutations. Follow up visit were done a year after the fetuses were born. Results: In 177 α thalassemia couples after prenatal diagnosis , 46 cases were normal(26.0%), 68 cases were heterozygous (38.4%) , and 63 cases(36.0%) were severe thalassemia, which included 55 Bart's hydrops syndrome and 8 Hb H disease. In 87 β thalassemia couples after prenatal diagnosis , 23 cases were normal(26.4%), 39 cases were heterozygous (44.8%) , and 25 cases(28.7%) were severe thalassemia, which included 9 cases of homozygous and16 cases of heterozygous. 5 families with α and β thalassemia were found that baby with 1 severe thalassemia, 1 α and β thalassemia, 2 heterozygote and 1 normal infant. Among the cases, 266 cases of fetal cells karyotype analysis were normal and 3 cases of fetal cells karyotype analysis were not normal, which included one 13 trisomy, one 21 trisomy and one 45, X. 63 cases with severeαthalassemia, 26 cases with severeβ thalassemia and 3 cases with chromosomal abnormality were aborted. Conclusion: In couples with the same thalassemia type, Bart's hydrops syndrome, severeHb H disease, severeβthalassemia(homozygous or heterozygous) can be. Rare mutations detection should be paid attention to. To eliminated the chromosome disease, at the same time of thalassemia detected, chromosome check should be also detected

Thalassemia；Geneotype；Prenatal diagnosis；Karyotype analysis

福建省科技廳重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目[2013YZ0002-1]；福建省臨床重點(diǎn)專科建設(shè)資助項(xiàng)目[20121589]；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[2012J01311]；福建省衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目[2012-CX-9]；福建省衛(wèi)生計(jì)生委中青年骨干人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目[2013-ZQN-ZD-6]

2016-03-23

2016-05-10

*通訊作者：alice-96@163.com

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.06

*Corrrespondingauthor：LINYuan,Email：alice-96@163.com