健脾益肺化痰方通過抑制TNF-α信號(hào)通路改善COPD大鼠氣道黏液高分泌的實(shí)驗(yàn)研究*

楊曉敏，趙娜妹，劉　娟，鄧秀蘭，王青青，張曉晶，潘　霏，李　配，鐘相根

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029）

·實(shí)驗(yàn)研究·

健脾益肺化痰方通過抑制TNF-α信號(hào)通路改善COPD大鼠氣道黏液高分泌的實(shí)驗(yàn)研究*

楊曉敏，趙娜妹，劉娟，鄧秀蘭，王青青，張曉晶，潘霏，李配，鐘相根

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029）

［目的］探討健脾益肺化痰方對(duì)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）氣道黏液高分泌的改善機(jī)制。［方法］采用煙熏法建立COPD大鼠模型，隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾益肺方組、化痰方組、健脾益肺化痰方組及羧甲司坦組。正常組、模型組灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)28 d。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α （TNF-α）含量，蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測(cè)肺組織表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）磷酸化水平。［結(jié)果］與正常組比較，模型組大鼠TNF-α含量升高，EGFR、PI3K和AKT磷酸化增強(qiáng)（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α含量顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），EGFR、PI3K和AKT磷酸化顯著下降（P＜0.01）或有下降趨勢(shì)。［結(jié)論］健脾益肺化痰方改善COPD大鼠氣道黏液高分泌，與抑制TNF-α等信號(hào)分子有關(guān)，且“標(biāo)本兼治”的作用優(yōu)于單一“治本”、“治標(biāo)”。

慢性阻塞性肺疾?。火ひ焊叻置?；健脾益肺化痰方；腫瘤壞死因子-α；表皮生長(zhǎng)因子受體

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，可伴有氣道高反應(yīng)性，疾病呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。氣道黏液高分泌是COPD的重要病理特征，已被確立為影響COPD病死率和病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而黏液高分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是氣管、支氣管樹杯狀細(xì)胞化生［1-3］。目前認(rèn)為，杯狀細(xì)胞化生主要依賴兩個(gè)互補(bǔ)途徑的持續(xù)激活：表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）-磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）信號(hào)防止纖毛細(xì)胞的凋亡和白細(xì)胞介素-13（IL-13）信號(hào)促使細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，且TNF-α信號(hào)通路異常激活在杯狀細(xì)胞化生、氣道黏液高分泌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-6］。而所謂的氣道黏液高分泌，就是中醫(yī)學(xué)的“痰”?！疤怠奔仁荂OPD重要的病理產(chǎn)物，又是其重要的致病因素。

本課題組以“黏液高分泌”或“痰”為切入點(diǎn)，采用單純香煙煙熏法復(fù)制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，以臨床常用的健脾益肺化痰系列方藥進(jìn)行干預(yù)治療，在觀察了健脾益肺方、化痰方及健脾益肺化痰方可顯著改善COPD大鼠肺功能、血?dú)饧胺谓M織病理的基礎(chǔ)上［7］，進(jìn)一步觀察健脾益肺化痰系列方對(duì)氣道黏液高分泌關(guān)鍵信號(hào)分子的影響，探討健脾益肺化痰系列方抑制COPD杯狀細(xì)胞化生、降低氣道黏液高分泌的效應(yīng)機(jī)制及“痰”標(biāo)本論治的差異性。

1　材料與方法

1.1藥物采用臨床治療COPD常用的健脾益肺化痰系列方藥，根據(jù)藥物功效與歸經(jīng)分為3組。健脾益肺方：四君子湯合玉屏風(fēng)散，組方：黨參15 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，白術(shù)10 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g?；捣剑憾悳咏酃；梅剑M方：法半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g，茯苓10 g，炙甘草5 g。健脾益肺化痰方：由四君子湯、玉屏風(fēng)散、二陳湯加桔?；梅浇M成，組方：黨參15 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，白術(shù)10 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g，法半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g。實(shí)驗(yàn)中采用的陽性參照藥物（西藥）為羧甲司坦。

中藥全部購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定均為正品。大鼠單位體質(zhì)量生藥量，在人體單位體質(zhì)量生藥量的基礎(chǔ)上擴(kuò)大10倍求得。各組藥物分別以純凈水煎煮30 min，提取2次，再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。羧甲司坦500 mg/kg灌胃，劑量參考文獻(xiàn)［8］。

1.2動(dòng)物與分組清潔級(jí)健康Wistar雄性大鼠，60只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量（180±20）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為正常組、模型組、健脾益肺方組、化痰方組、健脾益肺化痰方組、羧甲司坦組，每組10只。

各給藥組動(dòng)物，從吸煙第13周起，每日上午吸煙前0.5 h灌胃給予相應(yīng)藥液，連續(xù)用藥28 d。正常組和模型組給予等量純凈水灌胃。各組于末次給藥后，禁食12 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3COPD大鼠模型的制作參考文獻(xiàn)［8］，采用單純香煙煙熏法制備慢性被動(dòng)吸煙誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。模型組及各給藥組大鼠放入自制被動(dòng)吸煙玻璃熏箱，箱頂留有通氣孔，燃燒大前門牌香煙，由三通管導(dǎo)入煙霧。一次熏煙燃燒大前門香煙12支，每支香煙約產(chǎn)生煙霧1 L，煙霧濃度約5%，持續(xù)0.5 h，每日吸煙2次，上下午各1次，每周5 d，連續(xù)16周。

1.4試劑與儀器大前門牌香煙，上海煙草公司，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳含量14 mg；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒，CUSABIO公司；磷酸化PI3K抗體購自Abcam公司；磷酸化EGFR抗體和磷酸化AKT抗體購自CST公司。動(dòng)物熏煙箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制。

1.5ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液TNF-α的含量肺泡灌洗液的收集：動(dòng)物處死后，頸部正中切開皮膚，剪開肌肉后暴露氣管，眼科剪尖端向心與頸部平面呈30°剪一小口，直徑1.5 mm塑料軟管行氣管插管進(jìn)入2 cm，雙重棉線結(jié)扎固定。沿胸骨打開胸腔，暴露心肺，夾閉右主支氣管，注射器吸取生理鹽水與氣管插管相連。用4℃冷藏的生理鹽水灌洗左肺2次，30～60 s內(nèi)緩注4 mL，在左肺停留30 s，4 mL兩次，每次反復(fù)推抽2次，收集肺泡灌洗液（BALF），輕揉胸廓促進(jìn)灌洗液流出，注意動(dòng)作輕柔，回收率可達(dá)90%。4℃1000r/min離心10min，上清液-80℃保存待測(cè)。

ELISA法檢測(cè)：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，簡(jiǎn)述如下。分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL后，37℃溫育2 h。棄液，加生物素標(biāo)記抗體100 μL，37℃溫育1 h。棄液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素100 μL，37℃溫育1 h。顯色，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度，從而求得濃度。

1.6蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測(cè)肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平總蛋白提?。喝〈笫笥曳谓M織約100 mg，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑的混合液，超聲破碎，離心收集的上清即為組織總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，95℃變性后，-20℃凍存。

蛋白免疫印跡：取總蛋白100 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，1%奶粉封閉后，加入一抗4℃過夜。一抗為兔抗大鼠磷酸化EGFR、PI3K和AKT（pEGFR、pPI3K和pAKT），內(nèi)參選用β-actin。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的抗體，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光顯影，X線膠片感光。計(jì)算機(jī)掃描膠片，用圖像分析系統(tǒng)（Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件）對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，灰度值代表蛋白含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±ss）表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠肺泡TNF-α的檢測(cè)結(jié)果表1顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量均顯著降低（P＜0.01或P<0.05），提示健脾益肺化痰系列方能抑制COPD大鼠肺組織炎性介質(zhì)的分泌，降低杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白分泌的內(nèi)源性刺激因子。各健脾益肺化痰系列方組間比較，TNF-α含量均未見顯著性差異（P＞0.05）。

表1　各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量比較（±s）Tab.1　Comparison of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid of each group（±ss）

表1　各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量比較（±s）Tab.1　Comparison of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid of each group（±ss）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

分組正常組模型組健脾益肺方組化痰方組健脾益肺化痰方組羧甲司坦組動(dòng)物數(shù)8 8 8 8 8 8 TNF-α含量（ng/L）161.82±18.70 221.23±9.36** 198.00±8.29##204.89±16.64#202.00±16.81#202.95±18.85#

2.2各組大鼠肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平表2顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，健脾益肺化痰方組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT含量均顯著降低（P＜0.01），而健脾益肺組僅pEGFR、pPI3K含量顯著降低（P＜0.01），化痰方組僅pPI3K、pAKT含量顯著降低（P＜0.01），提示健脾益肺化痰系列方藥能抑制COPD大鼠肺組織EGFR、PI3K和AKT的磷酸化，下調(diào)氣道黏液高分泌、杯狀細(xì)胞化生關(guān)鍵信號(hào)分子的活性，作用以健脾益肺化痰方最佳。

表2　各組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT相對(duì)含量（±ss）Tab.2　Expression of pEGFR，pPI3K and pAKT in lung of each group（±ss）

表2　各組大鼠肺組織pEGFR、pPI3K和pAKT相對(duì)含量（±ss）Tab.2　Expression of pEGFR，pPI3K and pAKT in lung of each group（±ss）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

分組正常組模型組健脾益肺方組化痰方組健脾益肺化痰方組羧甲司坦組動(dòng)物數(shù)pPI3K/β-actin光密度比值pEGFR/β-actin光密度比值6 6 6 6 6 6 pAKT/β-actin光密度比值1 1 1 2.879±0.270**2.420±0.402**3.308±0.888** 1.612±0.300##　1.754±0.242##　2.817±0.947 2.589±0.611　1.593±0.294##　1.782±0.610##2.188±0.048##　1.996±0.112##　2.051±0.478##1.749±0.247##　1.741±0.046##　1.852±0.533##

3　討論

氣道黏液高分泌是COPD的重要病理生理學(xué)特征之一。黏液的過度分泌滯留于氣道，一方面進(jìn)一步加重氣道阻塞，引起通氣功能障礙，加速肺功能下降進(jìn)程；另一方面也引起纖毛清除功能障礙，影響COPD患者對(duì)吸入細(xì)菌和有毒顆粒的清除，病菌定植，誘發(fā)反復(fù)感染，進(jìn)一步刺激黏液高分泌的加重。這種感染和黏液高分泌相互促進(jìn)的惡性循環(huán)機(jī)制，使COPD病人肺功能慢性不可逆性持續(xù)降低。臨床研究表明，改善慢性阻塞性肺疾病患者氣道黏液高分泌，是治療COPD的有效途徑［9-11］。

TNF-α是氣道黏液高分泌、杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，也是COPD病情分級(jí)和療效的生物學(xué)指征。COPD患者血清中TNF-α含量隨患者疾病的嚴(yán)重程度增高，急性發(fā)作前高于緩解期，且用藥治療后顯著下降［12-14］。研究顯示，煙霧等因素刺激下，TNF-α轉(zhuǎn)化酶表達(dá)增加，可引起TNF-α分泌增加、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α含量升高，從而使表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）磷酸化增強(qiáng)，將刺激信號(hào)傳向細(xì)胞內(nèi)部［15-18］。EGFR信號(hào)通路在COPD黏液細(xì)胞增生中主要發(fā)揮抗凋亡作用，其通過下游的PI3K/AKT磷酸化激活，特異性的保護(hù)小氣道纖毛上皮細(xì)胞，使其免于凋亡，當(dāng)使用特異性EGFR和PI3K抑制劑時(shí)，可觀察到纖毛細(xì)胞的顯著凋亡，這說明EGFR/ PI3K是炎性因子刺激下，纖毛細(xì)胞成功存活并化生為杯狀細(xì)胞、分泌黏液的分子基礎(chǔ)［19-20］。

本課題組前期研究證實(shí)，健脾益肺化痰方可顯著減少COPD大鼠杯狀細(xì)胞數(shù)量，降低黏液高分泌狀態(tài)，但健脾益肺化痰方通過何種途徑抑制杯狀細(xì)胞化生、降低氣道黏液高分泌，其內(nèi)在機(jī)制還有待深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選用健脾益肺方（治本）、化痰方（治標(biāo)）及健脾益肺化痰方（標(biāo)本兼治），觀察系列方對(duì)COPD大鼠氣道黏液高分泌關(guān)鍵信號(hào)分子的影響，并對(duì)比分析三方對(duì)信號(hào)分子影響的差異。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，COPD組大鼠肺泡內(nèi)TNF-α增加，肺組織EGFR、PI3K和AKT磷酸化增強(qiáng)，提示氣道炎性因子分泌增加，且通過EGFR/PI3K信號(hào)通路，增強(qiáng)纖毛上皮細(xì)胞的抗凋亡能力，使其具備向杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)。與模型組比較，健脾益肺化痰系列方藥組大鼠均表現(xiàn)出肺泡TNF-α降低，肺組織EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平顯著降低或有下降趨勢(shì)，提示健脾益肺化痰系列方藥抑制杯狀細(xì)胞化生、改善COPD大鼠氣道黏液高分泌，與其抑制EGFR/PI3K信號(hào)通路有關(guān)。其中，健脾益肺化痰方組EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平均顯著降低，而健脾益肺組和化痰方組EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平僅部分下降，提示健脾益肺化痰方（標(biāo)本兼治）的抗黏液高分泌效果優(yōu)于健脾益肺方（治本）、化痰方（治標(biāo)）。因此，健脾益肺化痰系列方藥均可通過TNF-α/EGFR/ PI3K信號(hào)通路，抑制COPD大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌，且“標(biāo)本兼治”的作用優(yōu)于單一“治本”、“治標(biāo)”。

綜上所述，健脾益肺化痰系列方通過TNF-α/ EGFR/PI3K信號(hào)通路，抑制COPD氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制黏液高分泌，改善氣道阻塞及減少病原菌定植，這可能是健脾益肺化痰系列方改善COPD的效應(yīng)機(jī)制之一。本研究為健脾益肺化痰系列方治療COPD的作用機(jī)制研究提供了有益的科學(xué)探索。

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（本文編輯：馬英，張震之）

Experimental study on Jianpi Yifei Huatan decoction improvement airway mucus hypersecretion in COPD rats through inhibition of TNF-α signaling pathway

YANG Xiao-min，ZHAO Na-mei，LIU Juan，DENG Xiu-lan，WANG Qing-qing，ZHANG Xiao-jing，PAN Fei，LI Pei，ZHONG Xiang-gen
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

［Objective］To explore the mechanism of improvement of mucus hypersecretion in COPD rats by Jianpi Yifei Huatan decoction.［Methods］The rat model of COPD was established by tobacco smoke inhalation，and then the rats were randomly divided into the normal group，model group，Jianpi Yifei Huatan decoction group，Huatan decoction group，Jianpi Yifei Huatan decoction group and carbocisteine group.The normal group and model group were given normal saline solution intragastrically and other groups were given relevant medicines for 28 days，respectively.TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid was detected by ELISA，and phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in lung were detected by Western Blot.［Results］Compared with the normal group，the expressions of TNF-α，phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in model group rats were significantly higher（P＜0.01）.Compared with model group，the expressions of TNF-α，phospho-EGFR，phospho-PI3K and phospho-AKT in all treating group rats were significantly lower（P＜0.01 or P＜0.05）or with a downward tendency.［Conclusion］Jianpi Yifei Huatan decoction improves airway mucus hypersecretion in COPD rats through inhibition of TNF-α signaling pathway，and the role of“treating both symptoms and root causes”is better than single “treating symptoms”or“root causes”.

chronic obstructive pulmonary disease；mucus hypersecretion；Jianpi Yifei Huatan decoction；TNF-α；EGFR

R563

A

1672-1519（2016）05-0295-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173314，81473666）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科基本科研課題項(xiàng)目（2013-ZDXKKF-03）。

楊曉敏（1980-），女，博士，講師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療肺病。

鐘相根，E-mail：zhongxg@bucm.edu.cn。

2015-12-22）