高產(chǎn)地衣芽孢桿菌LB8培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

張曉晴 閔鐘熳

摘要：以自主分離的益生性地衣芽孢桿菌LB8為研究對(duì)象，通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到該菌株培養(yǎng)的最適條件為：培養(yǎng)時(shí)間20 h，葡萄糖2%，豆粕粉1.5%，硫酸鎂0.025﹪，NaCl為0.6%。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌；發(fā)酵條件；優(yōu)化；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2016）05-0045-04

微生物發(fā)酵受很多環(huán)境條件影響，除受pH、溫度、接種量影響外，還受培養(yǎng)基碳氮源、微量元素等影響。良好的外界環(huán)境不但有利于菌體生長，而且可提高微生物對(duì)底物的利用能力。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化就是選擇一組培養(yǎng)條件使菌株的生長潛力得到最大程度發(fā)揮。這樣不但可以降低成本、提高產(chǎn)率，而且可以促進(jìn)動(dòng)物微生態(tài)制劑商品化生產(chǎn)。針對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)地衣芽孢桿菌LB8的發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，確定適合芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，提高益生菌產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 地衣芽孢桿菌LB8（Bacillus licheniformis LB8）：自主分離自動(dòng)物腸道。

1.1.2 試劑與藥品 95%乙醇、鹽酸、蔗糖、MgSO4、NaCl、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、胰蛋白胨、（NH4）2SO4、豆粕粉

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖1.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5g，蒸餾水100 mL，pH 7.5。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 DK-S26型恒溫水浴鍋：上海精宏醫(yī)療器械廠；DL-CJ-1F超凈工作臺(tái)：東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；LDZX-40SAI型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SL1-700電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北黃石醫(yī)療儀器制造廠；BSA124S-CW電子分析天平：上海賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SHA-C恒溫振蕩搖床：常州國華電器有限公司；KA-1000低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)對(duì)地衣芽孢桿菌LB8發(fā)酵所需要的各項(xiàng)條件進(jìn)行單項(xiàng)優(yōu)化。

種齡的確定：用接種環(huán)從培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)基中挑取1環(huán)，接種于盛有30 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于32 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h。然后，按5%接種量將其轉(zhuǎn)接到300 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在同樣條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，連續(xù)測定48 h。每4 h取樣一次，平板菌落計(jì)數(shù)并記錄。

碳源的確定：將液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖分別用等量的乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖（對(duì)照）代替，5﹪接種菌種后測定活菌量，于32 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，確定最佳碳源。

氮源的確定：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨分別用等量的編號(hào)為①、②、③、④的胰蛋白胨（1.0 g）+酵母粉（0.5g）、豆粕粉、（NH4）2SO4、蛋白胨（對(duì)照）代替，以5%接種后，于32℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，測定活菌量，確定最佳氮源。

MgSO4對(duì)液體發(fā)酵的影響：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為0，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%的MgSO4，接種菌株培養(yǎng)后測定菌體生物量，研究MgSO4對(duì)LB8菌體活菌量的影響。

NaCl對(duì)液體發(fā)酵的影響：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的NaCl進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)后測定菌數(shù)，研究NaCl對(duì)LB8的活菌量的影響。

1.2.2 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用正交表優(yōu)化培養(yǎng)基。將LB8菌懸液接入不同培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)后測定菌體生物量，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定適合LB8生長的最佳培養(yǎng)基。L9（34）因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 種齡的確定 采用活菌計(jì)數(shù)法測定LB8不同時(shí)間的活菌數(shù)，以活菌數(shù)作為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪作菌體的生長曲線圖，見圖1。

由圖1可知：0～4 h為菌株延遲期，在這段時(shí)間，菌體很快得到復(fù)蘇；菌體在4～5 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，數(shù)量明顯增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)20 h時(shí)，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。因此該菌株最佳培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)為20 h。

2.2.2 最佳碳源的確定 如圖2所示，LB8以葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌體生物量較低，而以葡萄糖為碳源時(shí)菌量較大，菌數(shù)為4.5×109 CFU/mL。因此，葡萄糖可作為最適碳源。

2.2.2 最佳氮源的確定 由圖3可看出，LB8在不同氮源中的生長情況呈現(xiàn)較大差異，以豆粕粉為氮源時(shí)菌種生物量最大，菌量可達(dá)3.8×109 CFU/mL。所以宜選用豆粕粉為氮源。

2.2.3 MgSO4對(duì)液體發(fā)酵的影響 鎂離子作為多種酶的激活劑，對(duì)生物新陳代謝有很顯著的影響，對(duì)菌體的生長也不例外，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：Mg2+濃度在0.02%時(shí)菌量達(dá)到最大，隨著Mg2+濃度的進(jìn)一步增高，菌體數(shù)量呈下降趨勢。 2.2.4 NaCl濃度對(duì)液體發(fā)酵的培養(yǎng) 將菌種接種到不同濃度的NaCl培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：NaCl濃度在0.5%時(shí)，菌量最大，為5×109 CFU/ml；隨著濃度的增加，菌量下降，說明過高的NaCl濃度不利于菌體生長，適量的NaCl濃度對(duì)菌體生長繁殖有促進(jìn)作用。

2.2.5 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)分析 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2可知：各試驗(yàn)因素水平對(duì)LB8的生長有不同影響，四因素對(duì)LB8培養(yǎng)影響的顯著性次序?yàn)锳>B>D>C，即碳源濃度對(duì)菌數(shù)的影響最顯著，氮源濃度次之，硫酸鎂影響最小。在所選因素水平下，4種因素的最佳組合應(yīng)為A3B3C2D3，即葡萄糖2%，豆粕粉為1.5%，MgSO4為0.025%，NaCl為0.6%。

3 結(jié)論與討論

地衣芽孢桿菌LB8是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌株之一。體外試驗(yàn)證明，地衣芽孢桿菌對(duì)致病菌有很強(qiáng)的拮抗作用，能夠替代抗菌素起防病抗病作用。它能在腸道中產(chǎn)生大量的消化酶（如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等）和維生素（B族維生素，維生素K等），具有很強(qiáng)的抗消化道生境及較好的益生性。它還能增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而大大提高動(dòng)物的抗感染能力。目前，微生態(tài)制劑調(diào)控技術(shù)已經(jīng)成為解決養(yǎng)殖水域污染病害問題的有效手段之一。地衣芽孢桿菌LB8具有較好飼料蛋白質(zhì)和淀粉降解能力，在動(dòng)物養(yǎng)殖上具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

目前，地衣芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝較為成熟，但在飼料生產(chǎn)和環(huán)境污染治理等方面僅處在起步階段。在人們越來越關(guān)注食品安全、迫切希望減少抗生素使用的今天，地衣芽孢桿菌作為新一代飼料添加劑必將得到進(jìn)一步研究與應(yīng)用。因此，開展地衣芽孢桿菌制劑的研究和開發(fā)有廣闊的市場前景。

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Abstract： In this research the separate prebiotics Bacillus licheniformis LB8 taken as the research object， single factor and orthogonal test used to optimize the fermentation conditions， the optimum condition for the bacterial strain culture was obtained： the culture time 20 h， glucose 2%， soya been meal 1.5%， magnesium sulfate 0.025%， and NaCl 0.6%.

Key words： Bacillus licheniformi； fermentation conditions； optimize； orthogonal test