基于絲素蛋白的新型骨科內(nèi)固定材料的制備與表征

蒲小兵，鄭 冠，史成龍，馮星龍，張 濤，夏 虹，尹慶水，張 余

實(shí)驗(yàn)研究

基于絲素蛋白的新型骨科內(nèi)固定材料的制備與表征

蒲小兵，鄭 冠，史成龍，馮星龍，張 濤，夏 虹，尹慶水，張 余

目的探討基于可降解絲素蛋白的新型骨科內(nèi)固定材料的制備方法及其表征。方法采用三元溶液對脫膠后的天然蠶繭進(jìn)行溶解，經(jīng)過透析、凍干、再溶解等處理，得到具有良好力學(xué)性能的材料。掃描電鏡觀察材料表面及橫斷面的微觀結(jié)構(gòu)，能譜分析儀檢測材料表面的主要成分及元素組成，傅里葉變換紅外光譜儀分析特征譜帶；同時(shí)檢測材料的熱學(xué)性質(zhì)、接觸角、生物力學(xué)性能、吸水膨脹率和降解特性等。結(jié)果材料結(jié)構(gòu)致密，主要成分是C、N、O，在1 622.44 cm-1和1 513.98 cm-1處有明顯吸收峰。熱重分析和差示掃描量熱儀試驗(yàn)證實(shí)材料具有明顯的熱耐受性；表面接觸角為（106.8±0.9）°，呈明顯疏水性；生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明材料所能承受的平均最大載荷為（437±52）N，能夠滿足臨床骨科內(nèi)固定材料的要求。經(jīng)過改性的材料仍有一定的吸水性及可降解性：浸泡2 h吸水速度開始增快，48 h后基本達(dá)到飽和，最大吸水率為（30.7±0.3）%；隨著浸泡時(shí)間延長，材料直徑不斷增加，48 h時(shí)直徑增大率達(dá)（17.9±1.5）%；材料的降解曲線擬合符合二階函數(shù)規(guī)律。結(jié)論制備出的基于絲素蛋白的新型骨科內(nèi)固定材料具有結(jié)構(gòu)致密、熱耐受性良好、力學(xué)性能穩(wěn)定及可降解等優(yōu)點(diǎn)。

絲素蛋白；骨折固定術(shù)，內(nèi)；生物相容性材料；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，二級；生物力學(xué)；溫度；物理學(xué)；溶解度；生物降解，環(huán)境

Preparation and characterization of novel silk protein-based material for orthopaedic internal fixation

PU Xiaobing，ZHENG Guan，SHI Chenglong，F(xiàn)ENG Xinglong，ZHANG Tao，XIA Hong，YIN Qingshui，ZHANG Yu.Hospital of Orthopaedics，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Institute of Traumatic Orthopaedics of PLA，Key Laboratory of Trauma&Tissue Repair of Tropical Area of PLA，Guangzhou，Guangdong 510010，China

絲素蛋白是一種天然的蛋白材料，在骨組織工程中有廣泛的應(yīng)用前景，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道其作為骨科可吸收內(nèi)固定材料在骨缺損修復(fù)中應(yīng)用的可能性［1-2］，但未有研究對該材料進(jìn)行系統(tǒng)的材料學(xué)表征檢測。本實(shí)驗(yàn)采用改良的絲素蛋白提取方法，利用三元溶液溶解體系及六氟異丙醇等溶劑對脫膠后蠶繭進(jìn)行溶解，再用甲醇溶液處理，制備出具有良好力學(xué)特性的絲素蛋白骨科可吸收內(nèi)固定材料；并利用一系列材料學(xué)方法對材料形貌、結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行系列化表征研究，為骨科可吸收內(nèi)固定材料的選擇提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

1.1.1主要材料和試劑 PBS溶液、蛋白酶ⅩⅣ、無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇、六氟異丙醇、甲醇；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；家蠶蠶繭購自廣西百色。

1.1.2主要儀器 LC-210.2型電子天平、電磁爐、DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、透析袋、高溫爐、低溫冰箱、真空干燥機(jī)、稱重天平、PHS-2C數(shù)字式酸度計(jì)；酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）、離心機(jī)（Thermo公司，美國）、OCA15接觸角測量系統(tǒng)（Dataphysics公司，德國）、S-3700 N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）、INCA Energy 300能譜分析儀（Oxford公司，英國）、VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker公司，德國）、STA449F3熱重分析與差示掃描量熱儀（NETZSCH公司，德國）。

1.2基于絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的制備

1.2.1脫膠 量取5 000 mL去離子水，煮沸后加入0.06%的Na2CO33 g攪拌均勻，按浴比1∶50（w∶v）加入適量削口蠶繭煮沸脫膠3次，30 min/次，去離子水清洗干凈，烘箱內(nèi)烘干后溶解于摩爾比為1∶2∶8的三元溶液（CaCl2·CH3CH2OH·H2O）中2 h。1.2.2透析 將絲素溶液裝入透析袋，置于去離子水中4℃透析3 d，即得到絲素蛋白溶液。離心2次，20 min/次，18 000 rpm，—20℃冷凍3 d。

1.2.3再溶解 將冰塊狀絲素蛋白溶液凍干5～7 d，然后將得到的再生絲素蛋白剪碎后與六氟異丙醇溶液按1∶4比例再溶解，獲得再生絲素蛋白溶液。

1.2.4成形 將再生絲素蛋白溶液放入事先準(zhǔn)備好的模具中，置于甲醇中3 d，從純甲醇、六氟異丙醇到純水進(jìn)行梯度反應(yīng)，即分4次加水，每次間隔1 h，即得到棒狀材料，根據(jù)需要切成圓片狀。

1.2.5干燥 通風(fēng)櫥中干燥至少1周，60℃烤箱干燥5 d，得到基于絲素蛋白的骨科可吸收內(nèi)固定材料。

1.3電鏡觀察和能譜分析

取直徑3 mm、厚度1 mm的薄片樣品，清洗干燥后，在掃描電鏡下觀察材料表面及橫斷面的微觀結(jié)構(gòu)，用能譜分析儀檢測材料表面的主要成分及元素組成。

1.4紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測試樣品的特征譜帶，掃描分辨率2 cm-1，掃描范圍4 000 cm-1～5 000 cm-1。

1.5熱學(xué)性質(zhì)測試

采用熱重分析與差示掃描量熱儀對樣品進(jìn)行測試，掃描范圍50℃～600℃，升溫速率10℃/min，氮?dú)饬髁?20 mL/min。

1.6接觸角測量

將微量注射器固定于載物臺上方，調(diào)整攝像頭焦距以及攝像頭至載物臺的距離，加入樣品。調(diào)節(jié)采樣旋鈕以抽取1μL液體，緩慢升高載物臺，觸碰懸掛在進(jìn)樣器下端的液滴后下降，使液滴留在固體平面上。凍結(jié)圖像后測量材料表面多處接觸角，取平均值。作為判別潤濕情況的依據(jù)，通常把接觸角θ=90°作為潤濕與否的界限；θ＞90°為不潤濕；θ＜90°為潤濕，角度越小，潤濕性能越好；當(dāng)θ為0°時(shí)，液體在固體表面上鋪展，固體被完全潤濕。一般來說，材料與水的接觸角越大，其表面的疏水性越強(qiáng)。

1.7力學(xué)性能檢測

選取5件直徑4 mm、長度12 mm的棒狀樣品進(jìn)行三點(diǎn)彎實(shí)驗(yàn)：安裝夾具，試樣安裝在夾具力值傳感器一端，力傳感器回零，然后夾持試樣另一端，按一定預(yù)緊力緊固樣品；選擇電壓控制模式簡單拉試樣，粗略了解試樣最大載荷等物理特性；設(shè)定極限，選擇控制方式，設(shè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)自動調(diào)校；獲取設(shè)定數(shù)據(jù)后運(yùn)行試驗(yàn)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)后保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.8吸水膨脹率檢測

稱取樣品干重（Wd），量取直徑（Dd）。將6件樣品于37℃在PBS溶液中浸泡0、10、20、30 min，1、2、6、12、24、48、72、96、120 h。于相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)取出材料，濾紙清除表面水分，稱取樣品濕重（Ws），量取直徑（Ds）。根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：吸水膨脹率（%）=（Ws-Wd）/Ws×100%，直徑增加比率（%）=（Ds-Dd）/Ds×100%。

1.9降解性能檢測

取3件直徑0.5 cm、厚度0.1 cm的樣品，稱取初始重量（m0）后置入含1 mg/mL蛋白酶ⅩⅣ的PBS溶液中，37℃孵育，設(shè)置不含蛋白酶的PBS溶液作為對照組。每48 h更換1次溶液，1、2、4、8、12周后取出樣品，PBS溶液徹底洗凈、干燥、稱重（m1），并進(jìn)行掃描電鏡觀察。重量損失（%）=（m0-m1）/m0×100%。

2　結(jié)果

2.1大體結(jié)構(gòu)與微觀形貌

大體結(jié)構(gòu)上，基于絲素蛋白的骨科內(nèi)固定材料表面較光滑，可制成棒狀、板狀、螺釘?shù)炔煌螒B(tài)，具有良好的可加工性（圖1）。

在掃描電鏡100倍放大倍率下，可見材料表面均勻粗糙，這種粗糙表面既可增強(qiáng)其與骨界面的把持力，又有利于螺釘?shù)墓潭?；? 000倍放大倍率下，材料仍未見明顯孔徑（圖2）。能譜分析結(jié)果顯示，材料的主要成分是C、N、O（圖3），均為氨基酸結(jié)構(gòu)的主要成分。

圖1　材料制備形狀 可制成棒狀、板狀及螺釘形狀，具有良好的加工性能

圖2　材料掃描電鏡圖片（材料結(jié)構(gòu)致密，均無明顯孔徑）2A×100 2B×500 2C×1 000 2D×5 000

圖3　材料能譜分析儀檢測結(jié)果 主要成分是C、N、O及少量Ca離子

2.2紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉紅外光譜儀掃描結(jié)果顯示，材料主要為β-折疊構(gòu)像（圖4）。β-折疊成分越多，提示材料越穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度越好。材料伸縮振動峰在1 622.44 cm-1處（相當(dāng)于β折疊結(jié)構(gòu)的吸收峰），1 513.98 cm-1處為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)特征峰（圖4）。

2.3熱學(xué)性能

100℃時(shí)材料重量丟失極小，155℃時(shí)丟失1.54%，252℃時(shí)丟失8.21%，完全能夠耐受人體溫度（圖5）。

2.4接觸角

材料在未改性前親水，經(jīng)過六氟異丙醇、甲醇處理后，材料表面接觸角為（106.8±0.9）°，呈明顯的疏水性（圖6）。

2.5生物力學(xué)性能

5件材料樣本能承受的最大載荷分別為384.99、257.73、485.02、507.90、548.87 N，平均最大載荷為（437±52）N，能夠滿足臨床骨科內(nèi)固定材料的要求（圖7）。

2.6吸水膨脹率

如圖8所示，浸泡10 min時(shí)材料重量開始增加，2 h開始吸水速度增快，48 h后基本達(dá)到飽和，最大吸水率為（30.7±0.3）%。材料的直徑增長速度在浸泡2 h后開始增加，并隨著浸泡時(shí)間的延長而不斷加快，浸泡48 h時(shí)直徑增大率達(dá)（17.9± 1.5）%。

2.7可降解性能

如圖9所示，材料的降解曲線擬合符合二階函數(shù)規(guī)律，y=0.00087x2+0.2003x— 0.495，R2= 0.98。根據(jù)公式推導(dǎo)，材料在體外環(huán)境酶作用下降解3個(gè)月，重量減少百分比為24.57%，體外完全降解需要8個(gè)月。

圖4　材料的紅外光譜分析測試曲線 主要為β-折疊成分和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)

圖5　材料熱學(xué)性能分析結(jié)果 TG：熱重分析；DSC：差示掃描量熱儀

圖6　材料接觸角測試結(jié)果

圖7　材料生物力學(xué)測試結(jié)果

圖8　各時(shí)相點(diǎn)材料的體外吸水膨脹率 8A不同時(shí)相點(diǎn)PBS中樣品吸水率 8B不同時(shí)相點(diǎn)PBS中樣品直徑增大率

圖9　材料置于含1 mg/mL蛋白酶ⅩⅣPBS溶液中的重量減少擬合曲線

3　討論

目前在骨科領(lǐng)域，以鈦金屬為主要材料的內(nèi)固定系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，但存在以下缺點(diǎn)：剛度強(qiáng)，易造成骨折部位的局部應(yīng)力遮擋，導(dǎo)致骨再造不全或局部創(chuàng)面延遲愈合；材料的溫度和接觸敏感性也會增強(qiáng)患者的不適感覺；大部分患者需施行內(nèi)固定取出術(shù)，增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和醫(yī)療成本；金屬離子的降解易引發(fā)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致內(nèi)固定失敗等［3-5］。

骨科可吸收材料是一個(gè)新的研究方向，目前主要是聚乳酸等復(fù)合材料，能夠提高創(chuàng)傷后骨的再愈合能力［6-8］，但聚乳酸在降解過程中會產(chǎn)生一種酸性物質(zhì)，可導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)，產(chǎn)生無菌性竇道，進(jìn)而引起骨折不愈合、固定松動、創(chuàng)面難愈合等問題［9-10］。有鑒于此，人們目前致力于尋找一種可同時(shí)滿足剛度、強(qiáng)度、韌性、抗腐蝕性、生物相容性等要求的可吸收骨科內(nèi)固定材料。

作為一種天然的蛋白材料，絲素蛋白應(yīng)用歷史悠久。它主要包括18種氨基酸，由2條鏈緊緊纏繞，形成致密的蛋白空間構(gòu)象，即SilkⅠ和SilkⅡ結(jié)構(gòu)［11］。其中SilkⅠ結(jié)構(gòu)呈曲柄形，包括無規(guī)卷曲和α螺旋；SilkⅡ結(jié)構(gòu)為反平行β折疊，這種結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，是絲素蛋白的基礎(chǔ)構(gòu)象?？紤]到其外側(cè)包繞的絲膠蛋白是引起機(jī)體免疫反應(yīng)的主要原因［12］，故人們在提取絲素蛋白時(shí)需要進(jìn)行脫膠處理，通常采用堿水反復(fù)煮沸洗凈來實(shí)現(xiàn)脫膠。在對脫膠蠶絲進(jìn)行三元溶液溶解時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，85℃時(shí)蠶絲溶解速度最快；而所獲得的絲素蛋白經(jīng)凍干、六氟異丙醇再溶解后置于甲醇溶液中，其含無規(guī)卷曲及α螺旋結(jié)構(gòu)的SilkⅠ結(jié)構(gòu)將轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的SilkⅡ結(jié)構(gòu)，進(jìn)而得到力學(xué)強(qiáng)度良好、結(jié)構(gòu)致密的絲素棒或絲素板。

目前，絲素蛋白主要以膜、絲線、支架材料的形式應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［13-14］。有學(xué)者將絲素蛋白水溶液與絲素蛋白六氟異丙醇溶液分別制成支架材料，復(fù)合牙髓干細(xì)胞后植入裸鼠體內(nèi)，25周后2種植入材料均無明顯免疫反應(yīng)，前者完全降解，后者有部分剩余［15］；Wang等［16］分別將鹽瀝取法和六氟異丙醇處理制得的絲素蛋白多孔材料植入大鼠皮下，結(jié)果表明，材料在體內(nèi)均可降解，降解行為是可預(yù)測的，而其所引起的免疫反應(yīng)均較輕微；Meinel等［1］報(bào)道了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）植入絲素蛋白支架在生物反應(yīng)器中治療骨缺損的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白有明顯的成骨及促進(jìn)骨生長的作用，從而進(jìn)一步拓寬了絲素蛋白支架材料的應(yīng)用范圍。Park等［17］則指出，其所制備的靜電紡絲的絲素蛋白三維多孔支架可明顯促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和成骨分化能力；而在小鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，絲素蛋白支架組的新骨形成能力優(yōu)于聚乳酸支架組。另外多個(gè)研究結(jié)果亦證實(shí)，基于絲素蛋白的三維多孔支架材料在促進(jìn)成骨的同時(shí)，還具有良好的力學(xué)性能和生物相容性［18-20］。

基于絲素蛋白的復(fù)合材料研究也受到學(xué)者們的關(guān)注。Li等［21］嘗試以絲素蛋白納米纖維、骨形成蛋白-2和納米羥基磷灰石構(gòu)建復(fù)合絲素蛋白納米纖維，將人BMSCs接種于該纖維上，結(jié)果顯示該纖維能明顯上調(diào)人BMSCs成骨分化的相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)Ca2+沉積。

目前，基于絲素蛋白的骨科內(nèi)固定材料研究甚少，僅見Perrone等［2］將絲素蛋白材料用于大鼠骨折內(nèi)固定的實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果證實(shí)，絲素蛋白骨內(nèi)固定材料力學(xué)性能和生物降解性能良好，且不會引起炎癥反應(yīng)。但該研究未對其材料進(jìn)行系統(tǒng)的表征研究，且生產(chǎn)周期較長。我們改進(jìn)了傳統(tǒng)的再生絲素蛋白提取方法，即改變了脫膠蠶絲溶解時(shí)的溫度，加快了再生絲素的提取時(shí)間；同時(shí)改變了再生絲素與六氟異丙醇的比例，使其溶解得更加充分，制作出的材料具有更好的力學(xué)強(qiáng)度。我們對改良工藝制備出的材料進(jìn)行了完整的表征分析，結(jié)果顯示，該材料無明顯孔隙，材料表面利于增強(qiáng)其與骨之間的摩擦力，增強(qiáng)內(nèi)固定效果；材料的親水能力下降，可能在客觀上降低了細(xì)胞在材料上的可黏附性；生物力學(xué)強(qiáng)度方面亦能滿足臨床內(nèi)固定的需求。

但是，該材料的制備目前還存在一些不足：材料制備過程中，特別是制備較大形狀材料時(shí)易產(chǎn)生空泡，需要進(jìn)一步改善制備工藝；同時(shí)易出現(xiàn)形變，造成材料不必要的浪費(fèi)；材料的應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究來證實(shí)。

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（本文編輯：張輝）

XIA Hong，E-mail:gzxiahong2@126.com

Objective To explore the preparation method and characterization of a new silk protein-based material used for orthopaedic internal fixation.Methods Unglued natural cocoon was dissolved by ternarysolution，and then the material with good mechanical properties was obtained after the treatment of dialysis，freeze-drying and redissolution.Microstructures of the surface and cross section of the material were observed by scanning electron microscopy（SEM），main components and elements on the surface of the material were measured by energy disperse spectrometer，and the characteristic spectral lines were analyzed using Fourier transform infrared（FTIR）spectrometer；Thermal properties，contact angles，biomechanical properties，water absorption and degradation characteristics were examined simultaneously.Results Dense structure of the material was observed by SEM，carbon，nitrogen and oxygen were the major elements in the surface of the material，and the absorption peaks showed obvious distribution at 1622.44 cm-1and 1513.98 cm-1when using FTIR spectrometer. Thermogravimetric analyzer and differential scanning calorimeter tests proved that the material had the property of good thermal tolerance；Contact angle was（106.8±0.9）°，displaying significantly hydrophobic feature；Biomechanical test showed the average maximum load was（437±52）N，which was enough to meet the current mechanical need for orthopaedic fixation.Modified material was still absorbent and biodegradable:speed of water absorption began increasing 2 h after being soaked，and it reached saturation after 48 hours'soaking，with the maximum of the rate of water uptake was（30.7±0.3）%；Diameter of the material increased with the soaking time，and the increasing rate of diameter reached（17.9±1.5）%at 48 h after soaking；The degradation curve of the material conformation was in accordance with the rules of second-order function.Conclusion New developed silk protein-based material for orthopaedic internal fixation has the advantages of dense structure，good thermal tolerance，high mechanical stability and biodegradability.

Silk；Fracture fixation，internal；Biocompatible materials；Protein structure，secondary；Biomechanics；Temperature；Physics；Solubility；Biodegradation，environmental

R687.3；R61

A

1674-666X（2016）03-158-08

10.3969/j.issn.1674-666X.2016.03.005

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014M562668）

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前兩位作者對本文有同等貢獻(xiàn)，均為

夏虹，E-mail：gzxiahong2@126.com