四氫黃連堿體內(nèi)抗炎作用的研究

黃慧敏，柯昌虎，陳琴華

?

四氫黃連堿體內(nèi)抗炎作用的研究

黃慧敏，柯昌虎，陳琴華*

湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗中心,湖北 十堰 442008

[摘要]目的通過多種炎癥模型觀察四氫黃連堿的體內(nèi)抗炎作用。方法采用由多種炎性介質(zhì)參與的角叉菜膠致大鼠足腫脹模型、二甲苯致小鼠耳腫脹模型以及小鼠內(nèi)毒素休克模型，從整體上評價四氫黃連堿的體內(nèi)抗炎作用。角叉菜膠致大鼠足腫脹模型分為：空白對照組、四氫黃連堿高劑量組(21 mg/kg)、低劑量組(7 mg/kg)以及陽性藥地塞米松組(5 mg/kg)，空白對照組給予生理鹽水，其余各組給予相應劑量的藥物，30 min后，足跖皮下注射角叉菜膠，并分別在致炎前及致炎后1、2、3、4、5 h測量大鼠足趾厚；二甲苯致小鼠耳腫脹模型分為：空白對照組、四氫黃連堿高劑量組(30 mg/kg)、低劑量組(10 mg/kg)以及陽性藥地塞米松組(5 mg/kg)，空白對照組給予生理鹽水，其余各組給予相應劑量的藥物，連續(xù)給藥7 d，末次給藥30 min后于小鼠右耳涂抹二甲苯，左耳為對照，l h后處死，取相同部位的耳片并稱重；小鼠內(nèi)毒素休克模型分為：空白對照組、陰性組、四氫黃連堿高劑量組(30 mg/kg)以及低劑量組(10 mg/kg)，陰性組和空白對照組給予生理鹽水，其余各組給予相應劑量的藥物，給藥后30 min，陰性組和四氫黃連堿組腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白對照組給予等體積的生理鹽水，每隔12 h記錄1次小鼠的存亡情況，連續(xù)觀察72 h。結果角叉菜膠致大鼠足腫脹模型中，四氫黃連堿可顯著抑制大鼠足腫脹，高劑量組(21 mg/kg)對足腫脹的最大抑制率達到77.82%，低劑量組(7 mg/kg)對足腫脹的最大抑制率為62.39%，和陽性藥地塞米松組(5 mg/kg，最大抑制率80.54%)的作用相當；二甲苯致小鼠耳腫脹模型中，四氫黃連堿可顯著抑制小鼠的耳腫脹，其中高劑量組(30 mg/kg)對耳腫脹的抑制率達到74.03%，低劑量組(10 mg/kg)對耳腫脹的抑制率為53.93%，和陽性藥地塞米松組(5 mg/kg，抑制率64.71%)的作用相當；四氫黃連堿可顯著性提高內(nèi)毒素休克小鼠的存活率，其中高劑量組(30 mg/kg)內(nèi)毒素休克小鼠72 h內(nèi)的存活率為70%，低劑量組(10 mg/kg)為40%，四氫黃連堿組的存活率與陰性組(30%)相比差異有統(tǒng)計學意義。結論四氫黃連堿具有較強的抗炎、抗內(nèi)毒素休克作用，且抗炎機制可能與抑制炎性物質(zhì)的滲出和炎癥細胞因子的分泌有關。

[關鍵詞]四氫黃連堿；抗炎；足腫脹；耳腫脹；內(nèi)毒素休克模型

0　引言

四氫黃連堿是從我國傳統(tǒng)中藥如夏天無、延胡索、紫堇等植物中提取分離得到的一種原小檗堿型生物堿，目前對四氫黃連堿的研究多集中于含量測定方法的建立，對其生物活性尤其是抗炎活性的研究較少，故本研究通過角叉菜膠致大鼠足腫脹模型、二甲苯致小鼠耳腫脹模型以及小鼠內(nèi)毒素休克模型，對四氫黃連堿的體內(nèi)抗炎作用進行初步研究，從而豐富了四氫黃連堿的研究范圍。

1　材料

1.1實驗動物健康昆明種小鼠，20～25 g，SD大鼠，200～250 g，清潔級動物，由西安交通大學動物中心提供。

1.2實驗藥物及制備

1.2.1實驗藥物四氫黃連堿(寶雞市辰光生物工程有限公司，含量>98%)；地塞米松注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司)；脂多糖(Sigma，美國)；氯化鈉(西安化學試劑廠)；腫瘤壞死因子-α試劑盒(Rapidbio，美國)；二甲苯(西安化學試劑廠)；角叉菜膠(Sigma，美國)

1.2.2主要試劑的配制四氫黃連堿的配制：稱取四氫黃連堿40 mg，加0.1%的CMC-Na 20 mL，充分溶解制成濃度為2 mg/kg的溶液，儲存在4 ℃?zhèn)溆茫籐PS的配制：用三蒸水配制成2 mg/mL的母液，臨用前稀釋成所需濃度；1%角叉菜膠的配制：稱取適量的角叉菜膠，緩慢加入到0.9%的生理鹽水中，不斷攪拌，充分溶解后儲存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2　方法

2.1四氫黃連堿對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響取健康SD大鼠24只，體重200～250 g，雌雄各半，分為4組，每組6只，分別為：空白對照組，四氫黃連堿高劑量組(21 mg/kg)，四氫黃連堿低劑量組(7 mg/kg)，地塞米松組(5 mg/kg)，給藥劑量見表1。實驗組大鼠腹腔注射給藥，空白對照組注射等體積的生理鹽水，給藥后30 min，于每只大鼠的右后足跖皮下注射100 μL濃度為1%的角叉菜膠致炎，并分別在致炎前、致炎后1、2、3、4、5 h測量大鼠右后足趾厚。大鼠的足腫脹參照以下公式計算[1]：

腫脹度(mm)=Tt-T0

足腫脹抑制率(%)=

其中，T0表示注射角叉菜膠前大鼠右后足趾的厚度，Tt表示注射角叉菜膠后大鼠在t時的右后足趾厚度。

2.2四氫黃連堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響取體重20～25 g昆明種雄性小鼠，隨機分為4組，每組6只，即空白對照組，四氫黃連堿高劑量組(30 mg/kg)，四氫黃連堿低劑量組(10 mg/kg)，地塞米松組(5 mg/kg)。實驗組每天腹腔注射給藥，空白對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，末次給藥30 min后，立即在小鼠右耳正反面均勻涂抹二甲苯各20 μL，左耳為對照。1 h后，乙醚麻醉并脫頸處死，立即沿著耳廓基線剪下雙耳，并用點徑為9 mm的打孔器取相同部位的耳片，于萬分之一分析天平上稱重，計算腫脹度[2-3]：腫脹度(mg)=右耳片重-左耳片重；腫脹抑制率(%)=(對照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/對照組平均耳腫脹度×100%

2.3四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠存活率的影響取體重20～25 g的健康昆明種雄性小鼠100只，隨機分為5組，每組24只，分別為：空白對照組，陰性組，四氫黃連堿高劑量組(30 mg/kg)和四氫黃連堿低劑量組(10 mg/kg)。實驗組大鼠腹腔注射給藥，陰性組和空白對照組注射等體積的生理鹽水，給藥后30 min，陰性組和四氫黃連堿組腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白對照組注射等體積的生理鹽水。此后每隔12 h記錄1次小鼠的存亡情況，連續(xù)觀察72 h。

2.4四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影響取體重20～25 g的健康昆明雄性小鼠100只，隨機分為5組，每組24只，分別為：空白對照組，陰性組，四氫黃連堿高劑量組(30 mg/kg)和四氫黃連堿低劑量組(10 mg/kg)。實驗組大鼠腹腔注射給藥，陰性組和空白對照組注射等體積的生理鹽水，給藥后30 min，陰性組和四氫黃連堿組腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白對照組注射等體積的生理鹽水。在注射LPS的0、1、3、6 h處每組分別隨機取出6只小鼠，摘除眼球取血，于4 ℃ 4 500 r/min條件下離心10 min，收集血清并儲存于-20 ℃，待測TNF-α，測定方法詳見說明書。

3　結果

3.1四氫黃連堿對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響四氫黃連堿對角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹的影響用腫脹抑制率和腫脹度來評價，結果見表1。與對照組相比，四氫黃連堿高(21 mg/kg)、低(7 mg/kg)劑量組對角叉菜膠引起的大鼠足腫脹具有顯著的抑制作用。角叉菜膠致炎后3 h，足腫脹達到最大值。四氫黃連堿高、低劑量組以及地塞米松組對角叉菜膠誘導大鼠足腫脹的抑制率在致炎后1 h到達最大值，分別為77.82%(P<0.01)、62.39%(P<0.01)和80.54%(P<0.01)。

表1　四氫黃連堿對角叉菜膠誘導大鼠足腫脹的作用(n=6)

注：與對照組比較，**P<0.01

3.2四氫黃連堿對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響應用耳腫脹度評價四氫黃連堿對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的抑制作用，結果見表2。與對照組比較，四氫黃連堿高(30 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量組和地塞米松組(5 mg/kg)均能顯著抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹，且高劑量組的抑制作用強于陽性藥，抑制率分別為74.03%(P<0.01)、53.93%(P<0.01)和64.71%(P<0.01)。

3.3四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠存活率的影響實驗表明，實驗組小鼠腹腔注射LPS 12 h后出現(xiàn)死亡，48 h后死亡趨于穩(wěn)定。四氫黃連堿處理組可顯著提高內(nèi)毒素休克小鼠72 h內(nèi)的存活率：其中高劑量組(30 mg/kg)的存活率為70%，低劑量組(10 mg/kg)為40%，存活率與陰性組(30%)相比差異均有統(tǒng)計學意義，結果見圖1。

表2　四氫黃連堿對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的作用

注：與對照組比較，**P<0.01

3.4四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠血清TNF-α含量的影響實驗表明，四組小鼠在注射LPS前血清中TNF-α的含量差異無統(tǒng)計學意義，實驗組小鼠腹腔注射LPS后，血清中TNF-α含量均急劇上升，但與陰性組相比，經(jīng)四氫黃連堿處理的小鼠血清中TNF-α的上升趨勢被顯著抑制，結果見圖2。

圖1　四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠存活率的影響

*P<0.05，**P<0.01

圖2　四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影響

圖2　四氫黃連堿對內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影響

**P<0.01

4　討論

炎癥是機體對損傷因子做出的復雜的防御反應，是集損傷、抗損傷和修復為一體的綜合過程，藥理研究中觀察一個藥物是否具有抗炎作用，首先應在實驗動物上造炎癥模型。常見的炎癥模型分為非特異性炎癥模型和免疫性炎癥模型兩大類，前者分為急性炎癥模型與慢性炎癥模型。急性炎癥模型又分為：①以毛細血管通透性改變?yōu)橹饕卣鞯难装Y模型，常見的如醋酸致小鼠腹腔毛細血管的通透性升高；②以局部腫脹為主要特征的炎癥模型，常見的如大鼠蛋清、角叉菜膠型腫脹；③以白細胞游走、滲出為主要特征的炎癥模型，常見的如大鼠角叉菜膠胸膜炎[4-7]。結合已知的四氫黃連堿研究現(xiàn)狀，我們選用了角叉菜膠誘導大鼠足腫脹模型、二甲苯致小鼠耳腫脹模型、LPS誘導小鼠內(nèi)毒素休克模型，對四氫黃連堿的抗炎作用進行了較為全面的研究。

角叉菜膠致大鼠足腫脹模型是常用于評價或篩選藥物抗炎作用的經(jīng)典急性炎癥模型，當大鼠足跖內(nèi)注射角叉菜膠時，能誘導大鼠局部毛細血管擴張，增加血管通透性、滲出、水腫等一系列與人體急性炎癥相似的反應，由于該模型穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，常用于篩選抗炎藥物[7-9]。因此，本研究采用角叉菜膠致大鼠足腫脹模型，觀察四氫黃連堿的抗炎作用。結果顯示：注射角叉菜膠后，大鼠足部即開始發(fā)生炎癥并腫脹，致炎后3 h足腫脹達到高峰，此結果與國外相關報道較接近[10-12]，四氫黃連堿(21 mg/kg，7 mg/kg)預防性給藥對角叉菜膠所致大鼠足腫脹有顯著的抑制作用，且有一定的劑量相關性，其預防效果在致炎后1 h達到最大值，對足腫脹的抑制率分別為77.82%和62.39%，其中高劑量(21 mg/kg)的抑制率(77.82%)和陽性藥地塞米松的抑制率(80.54%)相當。

二甲苯誘導小鼠耳腫脹模型是常用的急性炎癥模型之一，其作用機制是引起小鼠耳部局部皮膚血管擴張，增加血管通透性，使大量炎癥介質(zhì)如前列腺素、組胺、血清素等滲出，從而造成耳部急性滲出性炎癥水腫[13]。在二甲苯致小鼠耳腫脹模型中，四氫黃連堿(30 mg/kg，10 mg/kg)可顯著抑制小鼠的耳腫脹，其中高劑量組(30 mg/kg)對耳腫脹的抑制率達到74.03%，預防效果明顯高于陽性藥地塞米松(64.71%)，其作用機制可能與抑制血管通透性以及抑制血管內(nèi)容物的滲出有關。

內(nèi)毒素休克過程中往往伴有炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-6的失控性釋放，這些細胞因子在內(nèi)毒素休克中發(fā)揮著重要的作用，可以引起肺組織淋巴細胞的浸潤，由淋巴細胞釋放的炎癥因子又可引起酸中毒和組織損傷，并最終導致器官功能障礙，甚至死亡[14-16]。細胞因子TNF-α是在炎癥早期產(chǎn)生的，是炎癥反應中激活細胞因子級聯(lián)反應的主要介質(zhì)，可在循環(huán)中較早出現(xiàn)并且迅速達到高峰，從而啟動其他一系列的細胞因子如IL-6的產(chǎn)生和釋放[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，四氫黃連堿可明顯提高內(nèi)毒素休克小鼠存活率，30 mg/kg四氫黃連堿組內(nèi)毒素休克小鼠的存活率達到70%；同時，我們用ELISA試劑盒檢測了內(nèi)毒素休克模型小鼠血清中TNF-α的含量，結果顯示，經(jīng)LPS刺激；小鼠血清中TNF-α的含量顯著升高，并在造模后1 h時達到峰值，四氫黃連堿預防性給藥，可顯著抑制內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNF-α的含量，并呈劑量依賴性，此結果和四氫黃連堿可提高內(nèi)毒素休克小鼠的存活率相一致。

綜上所述，四氫黃連堿具有較強的抗炎、抗內(nèi)毒素休克作用，且抗炎機制可能與抑制炎性物質(zhì)的滲出和炎癥細胞因子的分泌有關。

參考文獻：

[1]白山嶺,趙映前.牛黃的藥理作用及其用于抗肝損傷作用的研究進展[J].湖北中醫(yī)雜志,2011,33(5):65-67.

[2]梁生林,梁瓊,鐘衛(wèi)華,等.葒草提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用實驗研究[J].中草藥,2014,45(21):3131-3135.

[3]馬拴全,蔡國良,張水盈.創(chuàng)愈膏對炎癥動物模型的抗炎作用[C].中華中醫(yī)藥學會皮膚科分會第五次學術年會;全國中醫(yī),中西醫(yī)結合皮膚病診療新進展高級研修班論文集,2008.

[4]向敏,王建梅,顧瑤華,等.加味五味消毒飲提取物對小鼠角叉菜膠炎癥模型的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,21(12):1462-1465.

[5]Jang SI,Kim BH,Lee WY,et al.Stylopine from Chelidonium majus inhibits LPS-induced inflammatory mediators in RAW 264.7 cells[J].Arch Pharm Res,2004,27(9):923-929.

[6]Niu X,Fan T,Li W,et al.The anti-inflammatory effects of sanguinarine and its modulation of inflammatory mediators from peritoneal macrophages[J].Eur J Pharmacol,2012,689(1):262-269.

[7]黃媛恒,陳健,黃仁彬,等.玉郎傘提取物抗炎作用及機制研究[J].中國新藥雜志,2009,17(20):1764-1767.

[8]孫慧靜.吲哚-2,3-二酮對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響[J].山東醫(yī)藥,2011,51(6):30-31.

[9]張凌凌,潘景芝,張文婷,等.樹舌胞內(nèi)粗多糖的提取及其抗炎活性研究[J].菌物研究,2010,8(2):85-89.

[10]潘家祜.圓錐遠志水醇提取物對大鼠的胃保護作用[J].國外醫(yī)藥:植物藥分冊,2009,23(6):276.

[11]張群.靈桿菌多糖抗內(nèi)毒素作用及作用機制研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學,2012.

[12]陳好利,萬毅剛,趙青,等.糖尿病腎病腎組織炎癥信號通路p38MAPK的調(diào)節(jié)機制及中藥的干預作用[J].中國中藥雜志,2013,38(14):2268-2272.

[13]張圓.ERK1/2和NF-κB信號通路在電針上調(diào)內(nèi)毒素休克兔急性肺損傷血紅素氧合酶-1表達中的作用[D].天津:天津醫(yī)科大學,2014.

[14]尹美珍,李世普,袁琳,等.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].武漢大學學報:醫(yī)學版,2006,27(2):203-205.

[15]張曉龍,王婧,許卓再,等.大黃多糖對內(nèi)毒素誘導急性前葡萄膜炎TLR/NF-κB傳導通路干預作用的實驗研究[J].眼科,2013,22(2):134-140.

[16]Pankaj K,Sirshendu C,Sagar A,et al.Significant modulation of macrophages-associated cytokines TNF-α,VEGF and apoptotoic protein Bax,Bcl2 abrogates tumor cells[J].Cell Immunol,2013,284(1):172-181.

[17]蘇雪梅.NF-κB,TNF-α及PLGF與子癇前期發(fā)病及其嚴重程度的相關性研究[D].烏魯木齊:新疆醫(yī)科大學,2011.

收稿日期：2015-11-03

基金項目：十堰市科學技術研究與開發(fā)項目(15Y48)；湖北省自然科學基金面上基金(2015CFB615)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607010

Study on the anti-inflammatory activities of tetrahydrocoptisineinvivo

HUANG Hui-min,KE Chang-hu,CHEN Qin-hua*

(Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the anti-inflammatory effects of tetrahydrocoptisine in vivo by inflammatory models.MethodsThe acute inflammatory models of paw edema induced by carrageenan in rats,xylene-induced ear swelling models and endotoxin LPS-induced shock models in mice were observed in order to investigate the anti-inflammatory effects of tetrahydrocoptisine.The model rats of paw edema induced by carrageenan were randomly divided into four groups:blank control group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (21 mg/kg),low dosage group of tetrahydrocoptisine (7 mg/kg) and dexamethasone group (5 mg/kg).Rats were treated(i.p.) with tetrahydrocoptisine,dexamethasone or an equal volume of saline 30 min prior to receiving carrageenan in the right hind paw.The thickness of the paw was measured before and at 1,2,3,4 and 5 h after the injection of carrageenan with a micrometer.In ear swelling models induced by xylene,mice were randomly divided into four groups:blank control group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg),low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg) and dexamethasone group (5 mg/kg).Two doses (10 and 30 mg/kg) of tetrahydrocoptisine were administered (i.p.) to the two test groups,respectively.Dexamethasone group and blank control group were given dexamethasone (5 mg/kg) or the same volume of saline for 7 days.After the final treatment,xylene was applied to surfaces of the right ear of each animal.One hour after treatment with xylene,animals were killed by cervical dislocation and both ears were removed.Ear punch biopsies were collected and weighed.In the model of endotoxins shock of mice,four groups of mice were used:blank control group,negative group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg) and low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg).The two test groups received i.p.injection of tetrahydrocoptisine and the negative group received saline at 30 min before injection (i.p.) of 20 μg/kg LPS,while blank control group received an equal volume of saline.The survival rate of mice was recorded every 12 h,continuously for 72 h.ResultsTetrahydrocoptisine could inhibit the rat paw edema induced by carrageenan with the inhibition rate being 77.82% (21 mg/kg) and 62.39% (7 mg/kg),which was as effective as the dexamethasone (5 mg/kg,80.54%).Tetrahydrocoptisine could inhibit the mouse ear swelling induced by xylene with the inhibition rate being 74.03% (30 mg/kg) and 53.93%(10 mg/kg),which had the same efficacy as dexamethasone (5 mg/kg,64.71%).Tetrahydrocoptisine significantly improved the survival rate of mice with endotoxic shock with the rate being 70% in high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg) and 40% in low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg),which showed significant differences when compared with negative control group(30%).ConclusionTetrahydrocoptisine possesses obvious anti-inflammatory activity and protects the mice against LPS-induced endotoxic shock,which may be related to the inhibition of the overproduction of inflammatory cytokines.

Key words：Tetrahydrocoptisine;Anti-inflammatory;Paw edema;Ear swelling;Endotoxin-induced shock model