紅景天提取液對大鼠心肌缺血預處理的實驗研究

劉家軍，李龍珠，李賢玉

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紅景天提取液對大鼠心肌缺血預處理的實驗研究

劉家軍1，李龍珠1，李賢玉2*

1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院消化科，湖北 十堰

[摘要]目的探討紅景天提取液對大鼠心肌缺血預處理后的心肌保護作用機制。方法將20只健康大鼠隨機分為模型組、紅景天組，兩組均經(jīng)尾靜脈注射垂體后葉素，建立急性心肌缺血模型，紅景天組尾靜脈注射紅景天提取液2 mL/(kg·d)，模型組給予等體積生理鹽水。于缺血前及缺血預處理1周后，尾靜脈取血測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，斷頭取心，以ELISA法測定大鼠缺血心肌組織受體胎肝激酶1(FLK-1)蛋白及FLK-1a mRNA，缺氧誘導因子-1a(HIF-1a)蛋白及HIF-1a mRNA，缺血心肌組織中丙二醛(MDA)。結果與模型組及缺血預處理前比較,紅景天組在缺血預處理1周后FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表達明顯增強，CAT、SOD活性提高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論紅景天提取液可提高預處理后FLK-1蛋白、HIF-1a蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a mRNA表達及自由基清除酶活性，減輕急性心肌缺血大鼠血管內皮炎癥反應，抑制脂質過氧化反應，對心肌缺血有一定的保護作用。

[關鍵詞]大鼠；紅景天提取液；預處理；受體；丙二醛；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

0　引言

紅景天是主產(chǎn)于西藏、青海、西寧、四川等高寒地帶的景天科植物大花紅景天，其根莖可入藥，富含紅景天苷、紅景天苷元、沒食子酸、β-谷甾醇、二苯甲基六氫吡啶等多種有機成分[1]，根莖味甘澀性寒，歸脾肺經(jīng)，素有“高原人參”之稱[2]。已知其主要有效藥理成分為紅景天苷，具有抗缺氧、抗疲勞、抗寒冷、抗微波輻射，提高免疫力的作用[3]。還可增強心腦組織耐缺氧能力，在抑制缺血缺氧損傷引起的脂質過氧化、清除自由基等方面具有明顯作用[4]。本實驗用紅景天提取液對心肌缺血大鼠進行缺血前預處理1周，觀察紅景天提取液對心肌缺血預處理后的心血管內皮炎癥及心肌酶的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康Wistar大鼠20只，鼠齡45～60 d，體重(200±20)g，采用隨機數(shù)字表編號隨機分為模型組、紅景天組，每組10只。

1.2儀器及藥品BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司，型號：BL-420F)；紅景天(十堰市太和醫(yī)院中藥房提供生藥10 g)；戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，批號：061222)；CAT、MDA及SOD測試盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：KB13297)；大鼠FLK-1、HIF-1a蛋白、ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：mi028457)。

1.3大鼠缺血預處理及心肌缺血動物模型制備方法將紅景天生藥10 g加水200 mL熬制成100 mL藥液，定性濾紙過濾得到60 mL紅景天提取液，根據(jù)人與動物體表面積換算公式[大鼠用藥劑量(mg/kg)=W(人與大鼠體表面積換算系數(shù))×A(人用藥劑量)][5]，人用藥10 g/d，大鼠用藥量換算后可按2 mL/(kg·d)尾靜脈注射，模型組注入等體積生理鹽水對照，兩組動物均預處理1周。1周后參照文獻[6]方法造模，造模前夜不禁水，但停止喂食，造模時腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定后接Ⅱ導聯(lián)，用BL-420F記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。然后兩組動物用垂體后葉素(1.5 U/kg)經(jīng)尾靜脈注射后觀察Ⅱ導聯(lián)心電圖。當心電圖出現(xiàn)明顯的ST段上移、T波高聳或(和)期前收縮等心律失常時，即說明模型復制成功。術后將動物分籠飼養(yǎng)，12 h交替光照，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%。

1.4檢測指標及方法經(jīng)眼眶靜脈采預處理前后大鼠外周血，采用ELISA法測定大鼠外周血SOD、CAT酶活性，嚴格按MDA試劑盒說明檢測心肌組織MDA[7]。動物取血完畢后斷頭摘取心臟,分離左心室缺血部位心肌組織，分別編號，-30 ℃低溫冰箱暫存，檢測時取缺血心肌組織標本研磨，3 000 r/min高速離心20 min,然后取上清液，嚴格按ELISA試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ELISA法測定缺血心肌組織FLK-1蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白、HIF-1a mRNA表達。

2　結果

2.1紅景天提取液對大鼠外周血SOD、CAT及心肌MDA的影響兩組大鼠外周血SOD、CAT及心肌MDA在缺血預處理前差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組缺血預處理1 周時，血清SOD、CAT水平明顯降低，心肌MDA增高，與缺血預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。紅景天組SOD、CAT含量明顯增高，MDA降低，與預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示紅景天提取液具有促進SOD、CAT釋放及增強組織對自由基清除活性、抑制脂質過氧化反應的作用。見表1。

表1　大鼠心肌缺血預處理前后SOD、MDA及CAT水平比較

注：與預處理前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2紅景天提取液對大鼠FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表達的影響兩組大鼠缺血預處理前FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在缺血預處理1周后，模型組FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表達增強，與缺血預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。紅景天組FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA陽性表達較模型組均明顯增強，與模型組及本組預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3紅景天提取液對大鼠HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表達的影響兩組大鼠缺血預處理前HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組在缺血預處理1周后，HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表達呈升高趨勢，與本組預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示大鼠心肌缺血與HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表達密切相關；紅景天組HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA比模型組增加更明顯，與模型組及本組預處理前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示紅景天提取液具有顯著提高HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表達的作用。見表3。

3　討論

機體在正常情況下，氧自由基的生成與清除維持動態(tài)平衡，血管內皮及其功能保持完整性，當有心、腦、腎等組織器官創(chuàng)傷缺血梗阻后，由于某種原因(如手術或藥物治療)造成血液再通時，伴隨組織器官缺血再灌注會產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基會造成脂質過氧化反應，此時機體SOD、CAT等自由基清除酶活性急劇降低，造成自由基清除酶對氧自由基清除能力下降，MDA等代謝產(chǎn)物會大量產(chǎn)生，導致心肌等組織器官血管內皮細胞嚴重受損[8]。故MDA、SOD、CAT等在心肌細胞損傷或壞死時的含量變化可間接反映細胞受自由基損傷的程度。心臟支架、冠脈搭橋術、心肌梗死再通術、冠脈溶栓術等方法治療心肌梗死時，有可能引起心肌缺血/再灌注損傷而造成不良事件發(fā)生[9]，為避免這種嚴重后果，采用藥物進行缺血預處理不失為一種補救方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅景天的主要成分紅景天苷能增加缺血受損血管內皮細胞分泌VEGF，而FLK-1蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白、HIF-1a mRNA表達與VEGF的血管炎癥反應和血管再生密切相關，且紅景天苷具有明顯的抑制脂質過氧化反應[10-11]，還可擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈供血，解除冠狀動脈痙攣，對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用[12]。但由于其對心肌缺血預處理的機制鮮有系統(tǒng)的實驗報道，故本實驗采用紅景天提取液對大鼠進行1周的缺血預處理，觀察了其對心肌SOD等酶學及血管炎癥反應的影響，探討其作用機制，為其臨床治療及預防心肌缺血/再灌注損傷提供實驗及理論依據(jù)。

表2　大鼠心肌缺血預處理前后FLK-1a蛋白及FLK-1 mRNA表達比較

注：與預處理前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3　大鼠心肌缺血預處理前后HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA陽性表達比較

注：與預處理前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在進行缺血預處理1周后，其HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA、FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA的陽性表達均有不同程度增強，說明心肌缺血、缺氧可誘導其增殖，減輕心肌血管內皮受損的程度。紅景天組缺血預處理1周后，HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA、FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA的陽性表達較模型組明顯增強，這可能是因為紅景天提取液具有擴張冠脈、誘導缺血心肌組織的血管再生、促進缺血心肌組織側支循環(huán)建立而改善微循環(huán)、增加冠脈灌注和心肌供氧的作用，這也是紅景天活血化瘀的藥性特性之一。有研究認為，紅景天可促進機體Ca2+-ATP酶活性的恢復,增強Na+-K+-ATP酶活力,減少心肌血管Ca2+內流，避免細胞內鈣超載造成血管痙攣,并通過Na+-K+-ATP調節(jié)Na+-H+交換來抑制Na-Ca2+交換,擴張冠脈，改善缺血心肌組織供氧[13]，進而改善心肌缺血而起到保護作用[14]。亦有文獻報道，紅景天提取液具有改善缺血心肌組織的能量代謝，改善病灶缺血、水腫，促進細胞功能恢復，減輕缺血再灌注后組織損傷而起到保護心血管系統(tǒng)的作用[15-16]。同時，實驗證實，紅景天還能提高CAT、SOD活性，降低MDA含量，這也說明紅景天提取液可抑制脂質過氧化反應而達到保護缺血心肌的作用。

綜上所述，缺血預處理在臨床防治缺血性疾病尤其缺血/再灌注損傷中有重要的臨床意義，積極尋找減輕或降低心肌缺血/再灌注損傷的藥物意義重大。本實驗證實，紅景天提取液具有提高CAT、SOD自由基清除酶活性，抑制脂質過氧化反應，誘導FLK-1蛋白、HIF-1a蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a mRNA表達，減輕急性心肌缺血大鼠血管內皮炎癥反應的作用。在治療心肌缺血預處理上有廣泛的應用前景，但心肌缺血/再灌注損傷機制是一個多因素參與的復雜生理過程，紅景天提取液如何在缺血預處理各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮調節(jié)和干預作用，阻斷心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生，還有待于醫(yī)學科研工作者深入研究。

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收稿日期：2015-11-30

基金項目：湖北醫(yī)藥學院研究生啟動基金(2008QDJ9)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607005

Study on rhodiola liquor in myocardial ischemia preconditioning in rats

LIU Jia-jun1，LI Long-zhu1,LI Xian-yu2*

(1.Department of Digestion,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442012,China;2.Hubei University of Medicine,Shiyan 442012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective mechanism of rhodiola liquor in myocardial ischemic preconditioning in rats.MethodsTwenty healthy rats were randomly divided into model group and rhodiola group.The acute myocardial ischemia model was established with injection of posterior pituitary hormone through caudal vein.The rhodiola group was injected with rhodiola liquor [2 mL/(kg·d)] and the model group with saline [2 mL/(kg·d)) through caudal vein.The blood was gathered before heart ischemia and one week after heart ischemia.The protein and mRNA were extracted from myocardium.The activity of SOD and CAT was measured.The expression of HIF-1a,FLK-1,HIF-1a mRNA,FLK-1 mRNA and MDA was measured.ResultsCompared with the model group and the rhodiola group before myocardial ischemic preconditioning,the expression of FLK-1,FLK-1 mRNA,HIF and HIF-1a mRNA were significantly increased in the rhodiola group.The activity of SOD and CAT was significantly enhanced.However,the content of MDA was significantly decreased (P<0.05).ConclusionThe rhodiola liquor can increase the activity of free radical eliminate enzyme,FLK-1 protein,and HIF-1a protein,increase the expression of FLK-1 mRNA and HIF-1a mRNA,reduce acute inflammation reaction of vascular endothelium,and inhibit the lipid peroxidation,and it has protective effect on myocardial ischemia.

Key words：Rat;Rhodiola liquor;Pretreatment;Receptor;MDA;Superoxide dismutase;Catalase

442012；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442012