肺炎克雷伯菌分離株的耐藥性與毒力基因分布及相互關(guān)系研究*

趙瑞珂，李艷萌，2，顧國浩，韓清珍，趙麗娜，錢雪峰，張險峰，史進方，徐　杰△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科　215006；2.山東省日照市人民醫(yī)院檢驗科　276826)

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肺炎克雷伯菌分離株的耐藥性與毒力基因分布及相互關(guān)系研究*

趙瑞珂1，李艷萌1，2，顧國浩1，韓清珍1，趙麗娜1，錢雪峰1，張險峰1，史進方1，徐杰1△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科215006；2.山東省日照市人民醫(yī)院檢驗科276826)

目的研究肺炎克雷伯菌的耐藥性與毒力基因的分布及二者間的關(guān)系，為臨床合理使用抗菌藥物和控制感染提供依據(jù)。方法分離出172株肺炎克雷伯菌，采用紙片擴散法(K-B法)做藥物敏感試驗；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因。結(jié)果172株肺炎克雷伯菌分離株對頭孢菌素類頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟與頭孢曲松的耐藥率分別為38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因的陽性率分別為49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。肺炎克雷伯菌毒力基因分布與耐藥性呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論肺炎克雷伯菌毒力基因數(shù)與耐藥性密切相關(guān)，臨床應(yīng)注意抗菌藥物的合理應(yīng)用，防止肺炎克雷伯菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播。

肺炎克雷伯菌；毒力基因；耐藥性

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染常見的細(xì)菌，主要引起免疫力低下患者的各種感染，如原發(fā)性肺炎，存在于人體上呼吸道和腸道，當(dāng)機體抵抗力降低時，便經(jīng)呼吸道進入肺內(nèi)而引起大葉或小葉融合性實變，造成肺炎[1]。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物耐藥的重要原因。ESBLs基因多有質(zhì)粒介導(dǎo)，而這些質(zhì)粒常同時攜帶氨基糖苷鈍化酶、ampC酶、喹諾酮類等藥物的耐藥基因，表現(xiàn)出多重耐藥、交叉耐藥。近年來隨著廣譜抗菌藥物的不規(guī)范使用，多重耐藥的肺炎克雷伯菌檢出率不斷上升，這給臨床的治療帶來了很大的難題。

為了解肺炎克雷伯菌的耐藥性與致病性及二者間的關(guān)系，本研究對臨床分離的172株肺炎克雷伯菌進行耐藥性與毒力基因的分析，了解其耐藥譜和毒力基因分布，并分析二者間的關(guān)系，為臨床由肺炎克雷伯菌引起感染的治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源選擇2013年10月至2014年9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者分離出的肺炎克雷伯菌，共172株。同一患者同類標(biāo)本同一時期分離到的同種菌株不重復(fù)計入。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2鑒定與藥敏分離出的細(xì)菌均經(jīng)法國Bio-Merieux公司VITEK Ⅱ Compact鑒定，保存于-70 ℃。有效期內(nèi)用于抗菌藥物體外敏感試驗的藥物敏感試驗紙片：復(fù)方磺胺、氨芐青霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、亞胺培南，均購自英國Oxoid公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗采用紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗，結(jié)果參照2011版美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，對172株肺炎克雷伯菌分離株進行藥物敏感性判定。產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測SHV、TEM、CTX-M、OXAs基因確定。將耐一種抗菌藥物的簡稱為“耐藥模式一”，耐兩種抗菌藥物的簡稱為“耐藥模式二”，以此類推分析172株菌株的耐藥模式。

1.2.2DNA模板的制備水煮法制備DNA模板，99 ℃煮10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板，-20 ℃放置備用。

1.2.3PCR反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL的10× PCR buffer、1 U的Taq聚合酶、0.5 μL的上下游引物(20 μM)、2 μL的DNA基因組模板，ddH2O定容至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4 ℃ forever。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG基因的引物，引物均由華大基因有限公司合成。120 V恒壓瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物根據(jù)條帶長度進行判定。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，菌株耐藥統(tǒng)計分析時設(shè)定為“1”，敏感設(shè)定為“0”；毒力基因有為“1”，無為“0”， ESBLs組與非ESBLs組比較均值做獨立樣本t檢驗。利用SPSS 21.0軟件雙變量相關(guān)性分析，對分離株的多種藥耐藥率和毒力基因數(shù)關(guān)系進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1肺炎克雷伯菌對15種常見抗菌藥物藥敏檢測結(jié)果頭孢菌素類頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟與頭孢曲松的耐藥率依次為38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亞胺培南的耐藥率非常低(<15%)，見表1。肺炎克雷伯菌多重耐藥模式分析發(fā)現(xiàn)，耐3種以上抗菌藥物的百分率為37.2%，而且其多重耐藥譜主要集中于青霉素類、頭孢類、氟喹諾酮類為基礎(chǔ)的不同組合。全敏感菌株和“耐藥模式一”的構(gòu)成比為55.8%，這說明大部分菌株對15種抗菌藥物較為敏感，見表2。

2.2肺炎克雷伯菌分離株毒力基因分布比較分析毒力基因在172株肺炎克雷伯菌株中的分布，結(jié)果顯示，毒力基因rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG的陽性率分別為49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。ESBLs與非ESBLs肺炎克雷伯菌株間毒力基因檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。毒力基因在172株肺炎克雷伯菌中分布見表2。另外，172株肺炎克雷伯菌中含有一種毒力基因或多種毒力基因，其分布構(gòu)成比見表3。

2.3毒力基因分布與耐藥性之間的關(guān)系毒力基因數(shù)與耐藥性間的相關(guān)系數(shù)為-0.521，呈負(fù)相關(guān)，在P=0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。也就是說，毒力基因分布數(shù)越多的菌株，多重耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)的概率就越小。

表1　　172株肺炎克雷伯菌分離株的耐藥率[n(%)]

表2　　172株肺炎克雷伯菌不同毒力基因的分布率[n(%)]

表3　　肺炎克雷伯菌中毒力基因構(gòu)成比[n(%)]

3　討　　論

隨著高級別頭孢類抗菌藥物的大量使用，肺炎克雷伯菌對其耐藥率在逐年上升，這可能與其產(chǎn)ESBLs耐藥機制有關(guān)。本研究對172株肺炎克雷伯菌臨床分離株進行多重耐藥譜分析發(fā)現(xiàn)，耐3種及以上抗菌藥物的多重耐藥率達(dá)可達(dá)37.2%，而且其多重耐藥譜主要集中于哌拉西林(青霉素類)、頭孢類、慶大霉素、環(huán)丙沙星(氟喹諾酮類)等為基礎(chǔ)的不同組合。全敏感菌株和“耐藥模式一”的構(gòu)成比為55.8%，這說明大部分菌株對15種抗菌藥物較為敏感，可見肺炎克雷伯菌的耐藥并未出現(xiàn)大腸埃希菌的多重耐藥現(xiàn)象。

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的重要條件致病菌，常引起社區(qū)獲得性肺炎或醫(yī)院內(nèi)感染肺炎。肺炎克雷伯菌具有一些重要的毒力基因，其編碼蛋白在肺炎克雷伯菌與宿主間的侵襲、黏附、定植、抗吞噬等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，例如莢膜抗原、菌毛、抗血清殺菌活性和脂多糖、含鐵細(xì)胞相關(guān)的基因。magA基因編碼一種外膜蛋白，它參與肺炎克雷伯菌的保護性表多糖網(wǎng)絡(luò)的形成，并且其表達(dá)可致原發(fā)性肝膿腫以及轉(zhuǎn)移性的膿毒性并發(fā)癥[2]，而rmpA基因被180-kb質(zhì)粒編碼，它的表達(dá)控制著類黏蛋白的表型以及莢膜黏多糖的產(chǎn)生，這正是肺炎克雷伯菌能在體內(nèi)外試驗中保持抗吞噬能力的關(guān)鍵[3-4]。magA、rmpA基因的表達(dá)與高黏液表型形成密切相關(guān)[5]。Ybt可以使細(xì)菌菌體在呼吸道定植并通過規(guī)避Lcn2引起肺炎，亦是肺炎克雷伯菌的一個重要的致病因子[6]。Holt等[7]對300株肺炎克雷伯菌的全基因組測序和泛基因組數(shù)據(jù)分析研究發(fā)現(xiàn)，引起社區(qū)侵襲性感染的肺炎克雷伯菌與特定的毒力基因譜有關(guān)；與非侵襲性感染和攜帶的肺炎克雷伯菌相比，侵襲性肺炎克雷伯菌有rmpA、rmpA2和鐵攝取基因簇顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌rmpA、aer-1、gyrB、ybt基因檢出率非常高，肺炎克雷伯菌臨床分離株攜帶多種毒力因子，通過其功能發(fā)揮引起相關(guān)感染。

毒力與耐藥是細(xì)菌兩個重要致病性因素，在感染中發(fā)揮重要作用。本研究毒力基因分布數(shù)與耐藥性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，毒力基因數(shù)與耐藥性之間呈顯著負(fù)相關(guān)，越是耐藥的菌株，其攜帶的毒力基因個數(shù)越少；越是敏感的菌株，其攜帶的毒力基因個數(shù)越多。毒力基因數(shù)與耐藥性間呈負(fù)相關(guān)與本研究對尿路致病性大腸埃希菌毒力與耐藥性的研究結(jié)果相一致[8]；同時Shin等[9]的研究結(jié)論也和本研究結(jié)果相一致，即藥敏越敏感的菌株其致病性越強。Shin等[9]對產(chǎn)CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌基因型和毒力特征比較分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌沒有發(fā)生耐藥質(zhì)粒從耐藥菌株往敏感菌株轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象；產(chǎn)CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌的ST基因型不同，CTX-M某一基因型在醫(yī)院獲得性感染中占優(yōu)勢更傾向于用某一ST型的暴發(fā)來解釋，因此控制多重耐藥產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的傳播對于醫(yī)院感染控制工作尤為重要。本研究中毒力基因數(shù)與耐藥性負(fù)相關(guān)的結(jié)果表明，毒力的獲得與丟失和耐藥性的獲得與丟失間存在一定的關(guān)系。但是，有關(guān)毒力與耐藥之間的作用關(guān)系，還有待進一步深入探討。

綜上所述，肺炎克雷伯菌分離株對大多常見抗菌藥物表現(xiàn)為敏感，產(chǎn)ESBLs酶的菌株僅占24.4%，但臨床要重點關(guān)注與監(jiān)測頭孢類抗菌藥物使用選擇壓力下肺炎克雷伯菌獲得攜帶ESBLs基因的相關(guān)質(zhì)粒，及耐藥性產(chǎn)生、變遷與抗菌藥物使用變化間的關(guān)系。肺炎克雷伯菌分離株中存在大量與細(xì)菌莢膜形成、脂多糖合成、黏液型、抗吞噬、鐵獲取相關(guān)的毒力基因，如magA、rmpA、aerA、ybt基因。因此，醫(yī)院要關(guān)注和加強肺炎克雷伯菌的耐藥與毒力基因攜帶情況的監(jiān)測，規(guī)范合理使用抗菌藥物，防止耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。

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江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項目(Q201401)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項目(KYLX-1261)；蘇州市“科教興衛(wèi)”青年課題項目(kjxw2014008)。作者簡介：趙瑞珂(1986-)，在讀碩士，主要從事臨床細(xì)菌耐藥與致病機制研究。△

，E-mail:xuj2007@lzu.edu.cn。

R978.1

B

1671-8348(2016)20-2820-04

2016-02-18

2016-04-09)

·經(jīng)驗交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.027