腎上腺素β2受體對失血性休克大鼠骨骼肌PGC-1表達的影響

張　成，　高廣榮，　李　達，　單永琪，　張雪峰

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 麻醉科，遼寧 沈陽　110016

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·論著·

腎上腺素β2受體對失血性休克大鼠骨骼肌PGC-1表達的影響

張成，高廣榮，李達，單永琪，張雪峰

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 麻醉科，遼寧 沈陽110016

摘要：目的探討腎上腺素β2受體(AR-β2)對失血性休克(HS)大鼠骨骼肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子(PGC-1)表達的影響。方法將62只SD大鼠隨機分為對照組(n=6)、實驗組(n=28)和干預組(n=28)。按22.5 ml/kg放血建立HS模型。干預組放血后，立即給予ICI 118.551以0.5 mg/kg靜脈注射；休克30 min后，回輸放出的血和2倍放血量的林格氏液；復蘇期維持30 min，監(jiān)測血流動力學8 h。記錄建模前及建模后不同時點的紅細胞比容(Hct)、乳酸、剩余堿和血糖。采用蛋白印跡法及定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測不同時間骨骼肌組織PGC-1蛋白及mRNA表達的變化。結果休克模型建立后，血乳酸升高、剩余堿減少。與實驗組比較，干預組可以顯著降低血乳酸并增加堿剩余。休克組動物的死亡率明顯高于干預組。雖然復蘇后2 h，實驗組、干預組均出現(xiàn)PGC-1蛋白和mRNA的表達增加，但實驗組增加更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其后，兩組PGC-1蛋白和mRNA的表達均逐漸下降，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論HS時，AR-β2可對PGC-1基因表達進行適應性調節(jié)，進而調控能量代謝平衡。

關鍵詞：失血性休克；腎上腺素β2受體；過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.04.09

血清乳酸水平不但可以反映失血性休克(hemorrhagic shock，HS)中內環(huán)境代謝紊亂程度，還是判斷預后的重要指標[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了組織低灌注外，HS狀態(tài)下產(chǎn)生的高兒茶酚胺血癥可通過激活腎上腺素β2受體(β2-adrenergic receptor，AR-β2)-Na+-K+-ATP酶通路增加乳酸的產(chǎn)生[3-4]。AR-β2不但可以調節(jié)乳酸的生成，還能對寒冷、運動等應激狀態(tài)下骨骼肌內能量代謝調節(jié)基因的過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1)的表達進行調控[5-6]。本研究旨在探討AR-β2對HS大鼠的預后和骨骼肌內PGC-1表達的影響?，F(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料成年SD大鼠(第三軍醫(yī)大學動物實驗中心)。Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)護儀(芬蘭德恩公司)；壓力傳感器(新加坡Biosensors 公司)；聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(德國Biometra公司)；PE-50管(美國Sigma公司)；紫外分光光度計(英國UV-visible Spectrometer公司)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；微量輸液泵(WZ-50cz，浙大醫(yī)學器械有限公司)；血氣分析儀(Bayer Rapidlab 865型，德國Bayer公司)。RNA固定液(北京天恩澤基因科技有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程大連有限公司)；肝素鈉(天津生物化學制藥有限公司)。PGC-1引物合成(北京華大基因公司)。PGC-1抗體(sc-13067，美國SANTA CRUZ公司)。

1.2動物準備SD大鼠(體質量300～350 g)雌雄不限，實驗前12 h禁食，自由飲水。戊巴比妥那60 mg/kg腹腔內注射麻醉成功后，進行氣管內插管和小動物呼吸機輔助呼吸，潮氣量設定為7～8 ml/kg，呼吸頻率設定為80 次/min，吸入氧濃度為40%。分離左側股動脈及股靜脈后插管，分別用于放血和復蘇時液體回輸，右側頸動脈插管，用于監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。麻醉及置管結束后，待大鼠自然蘇醒，徹底清醒后穩(wěn)定2 h再開始建立失血性休克模型。

1.3HS復蘇模型建立采用定容性HS模型，根據(jù)體質量通過股動脈在10 min內勻速將40%的血容量(22.5 ml/kg)放出，放血速度為0.5 ml/min。抽出的血液儲存在肝素化(7.5 U/ml)的無菌注射器內，儲存于4℃冰箱中，待復蘇時回輸至大鼠體內。休克維持時間為30 min，30 min后，用輸液泵回輸放出的血和2倍放血量的乳酸林格氏液進行復蘇，復蘇期維持30 min。監(jiān)測大鼠血流動力學8 h。

1.4實驗分組62只大鼠隨機分為3組：(1)對照組(C組，n=6)：麻醉、置管，不建立模型；(2)實驗組(H組，n=28)，建立模型并復蘇；(3)干預組(N組，n=28)，放血后立即給予AR-β2特異性拮抗劑ICI 118.551，0.5 mg/kg靜脈注射[7]，余同H組。H組和N組分別在復蘇后2、4和8 h處死6只大鼠，采血并留取骨骼肌標本待檢測。H組和N組分別留取10只大鼠用于72 h生存分析。

1.5定量PCR法檢測PGC-1 mRNA表達RNA提?。篢RIzol一步法提取RNA。反轉錄：采用TaKaRa公司試劑盒合成cDNA，反應條件為37℃，15 min；85℃，5 s。PCR擴增：PGC-1引物序列，上游5′-agacagagcccagccagta-3′，下游5′-cccgtccttcagagcat-3′；β-actin引物序列，上游5′-tcatcaccattggcaatgag-3′，下游5′-cactgtgttggcgtacaggt-3′。PCR反應按下列條件循環(huán)：95℃、30 s，預變性，然后95℃、30 s，60℃、34 s，進行40個循環(huán)后，60℃、1 min延伸。根據(jù)標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結果，按2-△△CT法計算目標基因在實驗組和對照組中表達的相對水平。

1.6蛋白印跡法檢測PGC-1蛋白表達組織加入5倍體積預冷的細胞裂解液，冰浴下勻漿，再用冰水浴超聲粉碎。4℃下以12 000 r/min離心1 h，取上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。SDS-PAGE分離40 μg樣品后，電轉移至硝酸纖維膜上，封閉后，加入一抗(PGC-1，1∶500)室溫下免疫沉淀1 h，搖洗后加入標記二抗(1∶2 000)，室溫下作用2 h。ECL浸膜，顯影。照片在圖像分析儀上進行分析定量，記錄相應蛋白條帶的平均光強度值，并計算PGC-1和actin 吸光度值的比值。

1.7生化檢測指標在模型建立前[休克時間hemorrhagic shock time(HST)0 min]、模型建立后(HST 30 min)、復蘇后2 h(HST 180 min)及復蘇后4 h(HST 300 min)分別檢測紅細胞比容(Hematocrit，Hct)、乳酸、剩余堿和血糖。

2　結果

2.1血流動力學指標HS模型建立后，大鼠MAP降至約40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。模型建立120 min后，H組大鼠MAP為(84.0±10.7)mmHg，N組大鼠MAP為(72.0±11.7)mmHg；模型建立8 h后，H組和N組MAP分別為(105.0±8.2)mmHg和(94.0±10.0)mmHg。兩實驗組各個時間點MAP比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。HS模型建立后，大鼠心率升至約260 次/min。模型建立120 min后，H組大鼠心率降至(204.0±16.4)次/min，N組大鼠HR降至(182.0±12.7)次/min；模型建立8 h后，H組和N組心率分別為(194.0±12.8)次/min和(165.0±22.8)次/min。兩實驗組各個時間點心率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠MAP變化，血壓/mmHg)

表2　各組大鼠心率變化，心率/次·min-1)

2.2生化指標模型建立前后的各個時間點，H組和N組的Hct和血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在建模后，H組和N組BE值分別從(-3.1±1.0)nmol/L和(-2.8±1.2)nmol/L下降至(-9.4±2.3)nmol/L和(-4.3±1.1)nmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其后HST 180 min和HST 300 min，兩組差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在建模后，H組和N組乳酸水平分別從(0.9±0.1)mmol/L和(1.1±0.3)mmol/L上升至(17.3±3.8)mmol/L和(9.4±2.7)mmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同樣，其后HST 180 min和HST 300 min，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。2.3PGC-1 mRNA表達對照組大鼠骨骼肌組織內可見PGC-1 mRNA表達；復蘇結束2 h后，H組和N組大鼠的PGC-1 mRNA表達均明顯升高，分別是對照組的(2.00±0.45)倍和(1.04±0.64)倍，H組與N組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復蘇4 h和8 h后，H組和N組PGC-1 mRNA表達都逐漸下降，但兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

表3　模型建立前后生化指標變化±s)

注：與N組比較，①P<0.05

圖1　PGC-1 mRNA表達變化(兩組間2、4、8 h比較，P<0.05)

2.4PGC-1蛋白表達對照組大鼠肝臟組織內可見PGC-1蛋白的基礎表達；復蘇結束2 h后，H組大鼠的PGC-1蛋白表達明顯增加，是建模前的(1.95±0.35)倍。而N組大鼠的PGC-1蛋白表達略有減少，是對照組的(0.91±0.30)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復蘇4 h和8 h后，H組和N組PGC-1 蛋白表達逐漸下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.5生存情況H組和N組大鼠在休克期及復蘇期均無死亡，H組大鼠5只存活到72 h，另外5只大鼠分別存活12、18、24、30及36 h；N組大鼠8只存活到72 h，2只死亡大鼠分別存活48 h和60 h。Kaplan-Meier生存分析顯示，H組與N組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2　PGC-1 蛋白表達變化

3　討論

HS發(fā)生后，由于組織灌注不足，機體有氧代謝被抑制，無氧糖酵解增強，乳酸大量產(chǎn)生，能量代謝出現(xiàn)嚴重紊亂。如果代謝紊亂不能得到糾正，進一步發(fā)展會出現(xiàn)體溫下降、凝血障礙、心肌收縮性下降和血管反應性降低，進而危及患者生命[8]。

血清乳酸水平的高低不但能反映HS時能量代謝紊亂的程度，還是預后判定的重要指標[1]。傳統(tǒng)上認為，由于組織器官灌注不足導致的無氧糖酵解增強是導致高乳酸血癥形成的唯一原因。但近年研究發(fā)現(xiàn)，除組織低灌注外，由于應激產(chǎn)生的高兒茶酚胺血癥是乳酸大量生成的又一重要原因[3]。Luchette[9]在觀察腎上腺素受體拮抗劑對HS時乳酸水平的影響中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用腎上腺素α和β受體拮抗劑雖然對組織灌注沒有影響，但卻顯著降低了血清乳酸水平。Levy[3]的研究進一步證實，HS發(fā)生后腎上腺素可通過激活AR-β2-Na+-K+-ATP酶通路增加有氧糖酵解，進而導致乳酸大量產(chǎn)生，與低氧同為HS時乳酸產(chǎn)生的重要原因。這些研究結果證實了筆者在前期工作中的發(fā)現(xiàn)，采用麻醉和非麻醉狀態(tài)的巴馬香豬分別建立HS模型，雖然失血量相同，但非麻醉HS豬的乳酸水平平均是麻醉HS豬的8倍[10]，考慮麻醉減輕HS造成的應激反應，降低血清兒茶酚胺水平，導致乳酸水平的下降。

AR-β2不但可以調節(jié)乳酸的生成，還可以調控寒冷、運動等應激狀態(tài)下大鼠骨骼肌細胞內能量調控基因PGC-1的表達[5,11]。1998年，在小鼠體內發(fā)現(xiàn)PGC-1，其作為過氧化物酶體增殖物激活受體的轉錄輔激活因子，雖不直接結合DNA，但可通過與調節(jié)基因表達的結合轉錄因子相互作用誘導線粒體生物合成、呼吸和產(chǎn)熱作用，還能調節(jié)核呼吸因子1和2等基因的表達[12-13]。PGC-1能?？慷喾N轉錄因子，增強靶基因轉錄效率，廣泛參與多種代謝通路的調節(jié)活動，在適應性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸的β氧化及肝糖異生等過程中發(fā)揮著重要作用[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，休克復蘇模型制備2 h后，大鼠骨骼肌細胞內PGC-1蛋白和mRNA的表達均呈先明顯增高，而后逐漸下降的趨勢。李偉文等[15]在研究單純HS大鼠腸上皮細胞內PGC-1的表達變化時，也發(fā)現(xiàn)類似變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)HS后2～3 h腸上皮細胞內PGC-1的蛋白和mRNA表達明顯升高，而后逐漸下降。PGC-1的mRNA和蛋白在休克早期合成增多是機體的適應性調節(jié)反應，以便在能量供給不足時，線粒體合成增加和功能加強。隨著休克的進展，PGC-1的mRNA和蛋白的表達逐漸下降。目前，雖然其降低的機制尚不明確，但可考慮為能量代謝調控失代償在分子水平上的表現(xiàn)。

給予AR-β2拮抗劑后，大鼠骨骼肌內PGC-1的mRNA和蛋白表達在模型制備后早期即明顯下降，其后也一直維持在較低的水平。筆者認為，正是由于AR-β2拮抗劑抑制了休克時高腎上腺素血癥引起的高代謝狀態(tài)，因此，PGC-1的mRNA和蛋白表達才表現(xiàn)為適應性下調。這表明在HS的病理狀態(tài)下，AR-β2仍能夠通過反饋性調節(jié)調控PGC-1的表達，進而調節(jié)能量代謝。N組后期PGC-1蛋白和mRNA的低表達與H組的低表達也有不同的意義，前者是對相對低代謝需求的適應性調節(jié)，而后者是代謝耗竭后的失代償表現(xiàn)。血清乳酸和剩余堿的變化反映了這種差異。給予AR-β2拮抗劑后的各個時間點，N組的乳酸和剩余堿水平只有H組的一半。同樣，H組與N組大鼠的生存分析也證實N組具有明顯的生存優(yōu)勢。因此，實驗組兩組雖然后期PGC-1蛋白和mRNA的表達都呈下降趨勢，但其意義完全不同。

綜上所述，本研究從能量代謝角度出發(fā)，在分子水平探討了調控AR-β2治療HS的機理，結果表明抑制休克時，高腎上腺素血癥引起的代謝亢進有助于能量穩(wěn)態(tài)的維持，為HS的治療提供了新思路。

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基金項目：遼寧省自然科學基金(2013020218)；全軍“12.5”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金課題(CWS12J055)

通信作者：張雪峰，E-mail:cz1791@126.com

文章編號：2095-5561(2016)04-0220-05 中圖分類號：R441.9；R641

文獻標志碼：A

收稿日期：2016-05-17

Effects of β2-adrenergic receptor on expressions of PGC-1 in rat model of hemorrhagic shock

ZHANG Cheng，GAO Guang-rong，LI Da，SHAN Yong-qi，ZHANG Xue-feng

(Department of General Surgery,General Hospital of Shenyang Military Area Command,shenyang,110840,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of β2-adrenergic receptor on expressions of PGC-1 in skeletal muscles in rat model of hemorrhagic shock.Methodsds SD rats were randomized into three groups:Control(C),Hemorrhage(H)and Hemorrhage+AR-β2 (N).Venous blood(22.5 ml/kg)was continously withdrawn over 10 minutes to establish hemorrhagic shock model.Selective β2-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 (0.5 mg/kg)was intravenously administered after hemorrhage had finished.After 30 minutes shock periods,rats received whole blood and lactated Ringer′s solution resuscitation(1:2)for 30 minutes.Rats were monitored for 8h after resuscitation.Hematocrit(Hct),Base excess(BE),Lactate(Lac)and Glucose(Glu)were recorded at the baseline and different hemorrhagic shock time(HST).The expressions of PGC-1 mRNA and protein in skeletal muscles were tested by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)and western blotting.ResultsRats in Group N had lower lactate levels and higher BE levels than Group H (P<0.05).At 72 hours,there were five survivors in Group H and eight in Group N (P<0.05 versus Group H,Log Rank).Both Group H and Group N increased PGC-1 mRNA and protein expressions at 2 hours after resuscitation,but more higher expressions were seen in Group H compared with Group N (P<0.05).Thereafter,the expressions of PGC-1 mRNA and protein decreased gradually in both groups,and no statistic differences were found between the two groups.ConclusionAdrenergic receptor-β2 could regulate energy metabolism balance through adaptive regulation to PGC-1 during hemorrhagic shock.

Key words:Hemorrhagic shock；β2-adrenergic receptor；Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1

第一作者：張成(1971-)，男，遼寧遼陽人，主任醫(yī)師，博士