Smad4在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

劉巖青，盛吉章，趙磊，楊猛，楊文華 ，戴殿祿

(滄州市中心醫(yī)院，a腫瘤外二科，b心內(nèi)科，河北 滄州　061000)

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Smad4在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

劉巖青a，盛吉章b，趙磊b，楊猛a，楊文華a，戴殿祿a

(滄州市中心醫(yī)院，a腫瘤外二科，b心內(nèi)科，河北 滄州061000)

摘要：目的探討Smad4 mRNA的表達在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織之間的表達差異，及與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)與預(yù)后的關(guān)系。 方法選擇78例結(jié)腸癌手術(shù)切除的標本，選取結(jié)腸癌組織和相應(yīng)的癌旁正常組織；采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測兩組Smad4 mRNA表達水平，Kaplan-Meier法和Cox比例回歸模型分析Smad4 mRNA表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)與預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果結(jié)腸癌組織中Smad4 mRNA表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤、腫瘤TNM分期與Smad4-mRNA負相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-meier生存分析顯示Smad4高表達的結(jié)腸癌患者有更長的生存期。多因素分析結(jié)果顯示Smad4 mRNA表達水平是影響結(jié)腸癌預(yù)后的獨立影響因子。結(jié)論Smad4表達在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著抑制因子的作用，是影響結(jié)腸癌預(yù)后的獨立影響因子。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸腫瘤;Smad4蛋白質(zhì);聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)腸癌在全球范圍內(nèi)是發(fā)病率居第三位，病死率居第二位的惡性腫瘤[1-2]，在我國也有逐年增長的趨勢。結(jié)腸癌的發(fā)生及其發(fā)展是一個需要經(jīng)過多步驟、多階段的復(fù)雜過程[3]。Smad4基因位于人染色體18q21，是首先在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的新型抑癌基因，其所編碼的Smad4蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) 信號通路和骨轉(zhuǎn)化蛋白(BMP)通路的重要級聯(lián)分子，在信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Smad4表達缺失，其中大約30%～40%的結(jié)腸癌患者中存在Smad4基因的表達缺失或失活，研究表明Smad4在腫瘤演進的多種病理過程發(fā)揮著重要的作用。本研究采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中Smad4 mRNA的表達情況，并探討其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1　資料與方法

1.1病例收集及隨訪選取在滄州市中心醫(yī)院2007年1月至2008年12月就診的結(jié)腸癌患者經(jīng)手術(shù)切除并病理診斷的人新鮮結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織78例為研究對象，每例標本檢測的淋巴結(jié)數(shù)量均大于12枚，保存于-80℃冰箱中。其中男41例，女37例，男女比例1.10∶1，年齡35～78歲，中位年齡(58.3±7.8)歲。按NCCN結(jié)腸癌臨床實踐指南TNM標準進行分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期31例， Ⅲ 期13例，Ⅳ8例。同時收集患者的臨床資料還包括：腫瘤的大小、分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管血管浸潤。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。

患者的生存狀況通過電話隨訪、門診及住院復(fù)查的方式，隨訪截止至2015年3月20日。中位隨訪時間55月，隨訪期間58例患者無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，13例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，17例患者死亡，8例患者失訪。

1.2主要試劑Trizol購于Invitrogen公司，RNA純化試劑盒、2×SYBR Green Mix、MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase、dNTP、TaqDNA聚合酶等均購于美國Applied Biosystems 公司。

1.3Real-time PCR按 EZ Spin Column RNA Purification Kit 說明提取結(jié)腸癌組織及癌旁組織總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度A260nm/A280nm值均在1.8～2.0。以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后取出cDNA按1∶1稀釋，4℃保存。RT-PCR的引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成(表1)。采用SYBR Green 染色法檢測基因mRNA水平的表達。以β-actin為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算Ct值。摸索適當?shù)姆磻?yīng)條件，得到引物的最佳退火溫度58℃，每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)管，反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀自動分析各管的循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)。不同組別中各目的基因相對表達量用2-△Ct法進行計算，采用2-△△Ct法計算實驗組標本中目的基因表達相對于對照組表達的倍數(shù)。標本△Ct值=標本Ct值-標本內(nèi)參Ct值，△△Ct值=目的標本△Ct值-對照標本△Ct值[6]。

表1　PCR引物列表

2　結(jié)果

2.1Smad4 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達顯著低于癌旁正常組織經(jīng)RT-PCR檢測，Smad4 mRNA在癌組織中的相對表達量為0.723(25%～75% range：0.589～0.804)，癌旁組織中的相對表達量為2.176(25%～75% range：1.765～2.734)，結(jié)果證實兩組間Smad4 mRNA的表達水平相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Smad4 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平明顯低于其相應(yīng)的癌旁正常組織中的表達水平(圖1)。

圖1　結(jié)腸癌組織與相應(yīng)的癌旁組織中 Smad4 mRNA的表達水平對比表2　Smad4在結(jié)腸癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理指標例數(shù)Smad4mRNA的表達/例(%)高表達低表達P值性別男4120(48.8)21(51.2)0.821女3719(51.4)18(48.6)年齡<60歲3316(48.5)17(51.5)0.819≥60歲4523(51.1)22(48.9)腫瘤大小<5cm3219(59.4)13(40.6)0.167≥5cm4620(43.5)26(56.5)TNM分期Ⅰ2620(76.9)6(23.1)0.011Ⅱ3116(51.6)15(48.4)Ⅲ132(15.4)11(84.6)Ⅳ81(12.5)7(87.5)腫瘤分化程度低分化1810(55.6)8(44.4)0.905中分化3819(50)19(50)高分化2210(45.5)12(54.5)腫瘤位置左半結(jié)腸2712(44.4)15(55.6)0.922橫結(jié)腸111(64.7)6(35.3)7右半結(jié)腸3416(47.1)18(52.9)浸潤深度未侵透漿膜層4122(53.7)19(46.3)0.496侵透漿膜層3717(45.9)20(54.1)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性6237(59.7)25(40.3)0.001陽性162(12.5)14(87.5)血管淋巴管浸潤陰性7039(55.7)31(44.3)0.003陽性80(0)8(100)

2.2Smad4 mRNA 在結(jié)腸癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系78例結(jié)腸癌患者根據(jù)Smad4 mRNA表達水平的中位值將其分為高表達組與低表達組。結(jié)果證實高表達的Smad4 mRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴管血管浸潤呈明顯的負相關(guān)(均P<0.05)。Smad4 mRNA表達水平與年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤位置無相關(guān)性(均P>0.05)。見表2。

2.3Smad4 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，Smad4 mRNA高表達組5年生存率為82.1%，而Smad4 mRNA低表達組5年生存率僅為37.2%。Smad4 mRNA低表達組的5年生存率明顯的差于Smad4 mRNA高表達組，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，我們進一步將結(jié)腸癌患者分為早期組(Ⅰ、Ⅱ期)和進展期組(Ⅲ、Ⅳ期)，分別進行了生存分析，結(jié)果顯示，早期和進展期結(jié)腸癌患者中Smad4 mRNA低表達組的5年生存率均明顯的差于Smad4 mRNA高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖2)。

注：(A)早期結(jié)腸癌患者生存曲線圖。(B)進展期結(jié)腸癌患者生存曲線圖。

圖2Smad4低表達組與高表達組結(jié)腸癌患者生存曲線圖

Cox回歸模型分析結(jié)果顯示Smad4 mRNA表達水平為影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立影響因子(P<0.05)。單因素分析結(jié)果表明，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤及Smad4 mRNA表達水平均與結(jié)腸癌患者的預(yù)后有明顯相關(guān)(P<0.05)。進一步多因素分析結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤及Smad4 mRNA表達水平是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立的影響因子(P<0.05)(表3)。

表3　單因素和多因素分析影響結(jié)腸癌預(yù)后的因素

3　討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康和生命。目前雖然有治療手段多樣，包括手術(shù)治療、化療、靶向治療及生物免疫治療等，使早期結(jié)腸癌的治愈率明顯提高，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌的治療效果仍然不是很理想[7-8]。因此，尋找可以對結(jié)腸癌進行早期診斷及預(yù)測其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、評價預(yù)后和療效的分子標記物十分重要。

Smad蛋白是TGF-β家族的下游信號蛋白，在信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用。Smad蛋白根據(jù)功能不同分為受體激活性Smads、共同介導性Smads及抑制性Smads三類[9]。Smad2與Smad3均屬共同介導性Smad蛋白，其被磷酸化后與Smad4形成異源性多聚體，然后轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合，從而發(fā)揮激活DNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達的作用[10]。Smad4基因位于人染色體18q21[11]，其所編碼的Smad4蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路和骨轉(zhuǎn)化蛋白(BMP)通路的重要級聯(lián)分子，在信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用[5,12-13]。

有研究報道，Smad4在多種腫瘤中發(fā)揮著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲與轉(zhuǎn)移的能力，包括胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及食管癌[5,14-16]。Li等[17]報道Smad4低表達與結(jié)腸癌的淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況關(guān)系密切。Papageorgis等[5]經(jīng)體外實驗和動物實驗證實Smad4基因失活與結(jié)腸癌的腫瘤血管生成和化療耐藥有密切關(guān)系，但有關(guān)Smad4 mRNA水平與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系尚無明確定論。因此，我們采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中Smad4 mRNA的表達情況，研究證實，結(jié)腸癌組織中Smad4 mRNA的表達與相應(yīng)的癌旁正常組織中Smad4 mRNA水平的表達相比有明顯的降低。我們進一步研究了Smad4 mRNA的表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。低表達Smad4 mRNA與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤明顯相關(guān)。但是，Smad4 mRNA的異常表達與年齡、性別、發(fā)病部位及腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度等無明顯相關(guān)。Fukuchi等亦報道Smad4的表達與食管鱗癌的腫瘤分期、浸潤深度等有明顯的負相關(guān)，因此推測Smad4的低表達可能是結(jié)腸癌患者進展期中的晚期現(xiàn)象，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。雖然Smad4在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究尚不充分，但本研究揭示了Smad4 mRNA的表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，從臨床病例特征分析，Smad4在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著重要的作用，與國外研究Smad4蛋白表達與結(jié)腸癌的臨床病理參數(shù)間的關(guān)系的研究結(jié)果基本一致[18-20]。

Smad4在腫瘤預(yù)后中的作用結(jié)論不一。本研究通過對結(jié)腸癌病例的隨訪發(fā)現(xiàn)，Smad4 mRNA高表達組5年生存率為82.1%，而Smad4 mRNA低表達組5年生存率僅為37.2%，兩者相比有明顯的差異。這與Mesker等[18]報道的Smad4在早期結(jié)腸癌患者預(yù)后中的作用的研究結(jié)果是一致的。Hiwatashi報道，Smad4高表達的肝細胞癌患者有更差的預(yù)后[21]。但還有研究顯示，在食管鱗狀細胞癌患者中，Smad4mRNA高表達的患者有更好的預(yù)后，與本研究結(jié)果相似[22]。本研究結(jié)果顯示，Smad4 mRNA低表達組的5年生存率明顯的差于Smad4 mRNA高表達組，兩者之間相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，考慮到本研究中約2/3的患者為早期結(jié)腸癌患者，我們進一步將結(jié)腸癌患者分為早期組(Ⅰ、Ⅱ期)和進展期組(Ⅲ、Ⅳ期)，分別進行了生存分析，結(jié)果顯示，早期和進展期結(jié)腸癌患者中Smad4 mRNA低表達組的5年生存率均明顯的差于Smad4 mRNA高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，進一步排除了結(jié)腸癌分期對生存分析的干擾。何新陽等[23]報道，結(jié)腸癌的預(yù)后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)，因此我們首先單因素分析Smad4 mRNA表達、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤與結(jié)腸癌患者的總生存期相關(guān)，進一步多因素分析結(jié)果顯示Smad4 mRNA低表達是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一。本研究首次揭示了Smad4 mRNA低表達提示了結(jié)腸癌患者較差的總生存率，Smad4 mRNA有可能成為影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立影響因子。然而調(diào)控Smad4 mRNA表達的分子機制并不清楚，還有待進一步的研究。

總之，本研究證實Smad4 mRNA在結(jié)腸癌組織的表達下調(diào)。Smad4 mRNA 表達與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管淋巴管浸潤明顯相關(guān)。所有結(jié)果顯示Smad4的低表達與結(jié)腸癌的侵襲性相關(guān)，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，Smad4是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立的影響因子，為結(jié)腸癌的治療及預(yù)后提供了新的靶點。

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通信作者：戴殿祿，男，主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：daidianlu111@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.030

(收稿日期：2016-02-20，修回日期：2016-05-15)

Correlation of Smad4 expression with clinical characteristics and its relevance to prognosis in colorectal carcinoma

Liu Yanqinga,Sheng Jizhangb,Zhao Leib,et al

(a.DepartmentofOncology;b.DepartmentofCardiology,CangzhouCentralHospital,Cangzhou,Hebei061001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the Smad4 mRNA expression in colon cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues and its potential relevance to clinicopathological variables and prognosis.Methods78 cases of colorectal cancer samples including colon cancer tissues,paracancerous normal tissues were selected.Smad4 mRNA expression of the 2 groups were detected by real-time fluorescence quantitative (RT-PCR).Kaplan-Meier analysis and Cox proportional hazards regression models were used to investigate the correlation between Smad4 expression and prognosis of colon cancer patients.ResultsThe expression level of Smad4 mRNA in colon cancer tissues was significantly lower than that of the paracancerous tissues and normal tissues (P<0.05).Our results indicated that lymph node metastasis,angiolymphatic invasion,and TNM staging were negatively correlation with Smad4 mRNA expression (P<0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that patients with high Smad4 expression have longer overall survival.Multivariate analysis revealed that Smad4 expression was an independent predictor of overall survival.ConclusionSmad4 might play a negative role in colon cancer development and could serve as an independent predictor of prognosis.

Key words:Colonic Neoplasms;Smad4 Protein;Polymerase Chain Reaction